Un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une a IL-8 humana que comprende las seis secuencias de CDR VLCDR1 de SEC ID Nº:

16, VLCDR2 de SEC ID Nº: 17, VLCDR3 de SEC ID Nº: 18, VHCDR1 de SEC ID Nº: 22, VHCDR2 de SEC ID Nº: 23 y VH CDR3 de SEC ID Nº: 24

Anticuerpos monoclonales humanos contra interleucina 8 (IL-8)

Antecedentes de la invención

Las quimiocinas representan una superfamilia de aproximadamente 30 citocinas quimiotácticas que actúan de iniciadores y promulgadores vitales de reacciones inflamatorias. Oscilan de 8 a 11 kD de peso molecular, son activas en un intervalo de concentración de 1 a 100 ng/ml y son producidas por una amplia variedad de tipos de células.

La interleucina 8 (IL-8) , anteriormente llamada factor quimiotáctico de neutrófilos derivados de monocitos (MDNCF) o proteína-1 atrayente/de activación de neutrófilos (NAP-1) , es una quimiocina y un miembro de la familia de las citocinas que muestra actividad quimiotáctica para tipos específicos de leucocitos. La IL-8 es un miembro de la familia de las quimiocinas CXC en la que un aminoácido está presente entre los dos primeros de los cuatro residuos de cisteína altamente conservados. La IL-8 es un polipéptido del que dos formas predominantes consisten en 72 aminoácidos y 77 aminoácidos. Los monocitos, macrófagos, neutrófilos, linfocitos, fibroblastos dérmicos, queratinocitos, células endoteliales vasculares, melanocitos, hepatocitos y diversas líneas celulares tumorales producen IL-8. La IL-8 es una potente quimiocina neutrófila y participa en la migración de neutrófilos hacia sitios inflamatorios. Tras la unión a sus receptores de alta afinidad (CXCR1 y CXCR2) que están presentes sobre la superficie de neutrófilos, la IL-8 activa los neutrófilos acelerando la desgranulación y elevando la concentración de Ca2+ libre en el citoplasma y también induce migración de neutrófilos para así destruir el tejido infiltrado.

Aunque la respuesta inflamatoria de los neutrófilos es esencial para la destrucción de bacterias que están invadiendo el cuerpo, la activación inapropiada de neutrófilos puede producir varios trastornos inflamatorios. Por ejemplo, se ha recuperado IL-8 de sitios inflamatorios tales como lesiones de pustulosis palmoplantar (PPP) , escamas psoriásicas, líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (AR) , líquido pleural de pacientes con empiema, macrófagos alveolares de pulmones con fibrosis pulmonar idiopática, líquidos de lavado broncoalveolar de pacientes con síndrome disneico del adulto, fibrosis quística, bronquitis crónica y bronquiectasia. La IL-8 también está asociada a septicemia, asma, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria del intestino (EII) , lesión por isquemiareperfusión y mieloma múltiple. Tales afecciones se caracterizan por inflamación acompañada de infiltración de neutrófilos y lesión de tejido.

También se sabe que la IL-8 promueve angiogénesis y, por tanto, el crecimiento de tumores. Tal actividad se ha asociado al motivo de ELR dentro de la secuencia de IL-8. Las líneas celulares tumorales humanas tales como carcinoma tiroideo, carcinoma de células transitorias, triquilemona, carcinoma de células escamosas y melanoma que expresa constitutivamente IL-8 que desempeña una función en la invasión y metástasis de tumores.

Por consiguiente, los anticuerpos específicos para IL-8 son terapéuticamente importantes para tratar enfermedades mediadas por actividad de IL-8. Previamente se ha descrito un hibridoma que produce un anticuerpo humano contra IL-8 humana, denominado en lo sucesivo 2C6 (patente de EE.UU. nº 6.300.129 por Lonberg y Kay) . Sin embargo, todavía se necesitan anticuerpos adicionales específicos para IL-8.

También se reconocen los siguientes documentos: Yang y col. (1999) Journal of Leukocyte Biology 66:401-410 y Huang y col. (2002) American Journal of Pathology 161:125-134, que están ambos relacionados con anticuerpos anti-IL-8 completamente humanos para posibles aplicaciones terapéuticas. Los documentos WO 01/40306 y WO 01/25492, que están ambos relacionados con el anticuerpo M1-25 anti-IL-8 humano.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales humanos aislados que se unen a IL-8 humana, además de moléculas biespecíficas y multiespecíficas y otras composiciones terapéuticas que contienen tales anticuerpos, solos o en combinación con agentes terapéuticos adicionales.

En particular, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une a IL-8 humana que comprende las seis secuencias de CDR VLCDR1 de SEC ID Nº: 16, VLCDR2 de SEC ID Nº: 17, VLCDR3 de SEC ID Nº: 18, VHCDR1 de SEC ID Nº: 22, VHCDR2 de SEC ID Nº: 23 y VHCDR3 de SEC ID Nº: 24.

La invención también proporciona los anticuerpos y composiciones de la invención para su uso en procedimientos para tratar una variedad de enfermedades mediadas por IL-8.

Los anticuerpos completamente humanos de la presente invención se unen a IL-8 e inhiben la función de IL-8 (y los efectos mediados por IL-8) bloqueando la unión de IL-8 a su receptor. Por ejemplo, los anticuerpos pueden inhibir efectos proinflamatorios y angiogénicos inducidos por IL-8 tales como actividad quimiotáctica inducida por IL-8 para leucocitos y flujo de calcio inducido por IL-8. Los anticuerpos también pueden inhibir el aumento de expresión inducido por IL-8 de CD11b (Mac-1) y la disminución de la expresión de L-selectina (CD62L) . Por consiguiente, anticuerpos particulares de la invención tienen una o más de las siguientes características:

(i) inhibe la unión de IL-8 a sus receptores (CXCR1 y CXCR2) ;

(ii) inhibe los efectos proinflamatorios inducidos por IL-8;

(iii) inhibe la actividad quimiotáctica inducida por IL-8 para neutrófilos;

(iv) inhibe el flujo de calcio inducido por IL-8;

(v) inhibe los cambios inducidos por IL-8 en los niveles de expresión de moléculas de adhesión sobre neutrófilos;

(vi) inhibe el aumento de la expresión inducida por IL-8 de CD11b (Mac-1) e inhibe la disminución de la expresión inducida por IL-8 de L-selectina sobre neutrófilos;

(vii) no reacciona de forma cruzada con quimiocinas relacionadas seleccionadas del grupo que consiste en GRO-a humana, GRO-º humana, IP-10 humana y NAP-2 humana;

(viii) inhibe significativamente la quimiotaxia inducida por líquidos biológicos que contienen múltiples factores quimiotácticos que incluyen IL-8.

Por tanto, los anticuerpos humanos de la presente invención proporcionan un medio mejorado para su uso en el tratamiento y la prevención de trastornos mediados por actividad de IL-8 atribuibles en parte a su especificidad única (por ejemplo, especificidad por epítopes y falta de reactividad cruzada con quimiocinas relacionadas) , afinidad, estructura, actividad funcional y el hecho de que sean completamente humanos, haciéndolos significativamente menos inmunogénicos y más terapéuticamente eficaces y útiles cuando se administran a pacientes humanos que otros anticuerpos para IL-8 previamente generados (por ejemplo, anticuerpos murinos y humanizados) .

Anticuerpos humanos aislados de la invención incluyen una variedad de isotipos de anticuerpos tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgA secretora, IgD y IgE. Normalmente, incluyen isotipos IgG1 (por ejemplo, IgG1, K o IgG1A) , IgG3, IgG4 y IgM. Los anticuerpos pueden ser intactos (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG3) o pueden incluir sólo una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F (ab') 2, Fv o Fv monocatenario) .

Anticuerpos terapéuticos particulares de la invención incluyen el anticuerpo monoclonal humano (HuMab) 10F8.

Los anticuerpos humanos de la invención comprenden un dominio de CDR que tiene una región CDR1 de cadena pesada y ligera humana, una región CDR2 de cadena pesada y ligera humana y una región CDR3 de cadena pesada y ligera humana, en el que el anticuerpo comprende las seis secuencias CDR VL CDR1 de SEC ID Nº: 16, VL CDR2 de SEC ID Nº: 17, VL CDR3 de SEC ID Nº: 18, VH CDR1 de SEC ID Nº: 22, VH CDR2 de SEC ID Nº: 23 y VH de SEC ID Nº: 24.

También se refiere a anticuerpos que se unen a un epítope sobre IL-8 humana definida por el anticuerpo 10F8, y/o que compite por la unión a IL-8 con el anticuerpo 10F8, o que tienen otra unión funcional característica presentada por el anticuerpo 10F8. Tales anticuerpos incluyen aquellos que se unen a IL-8 con una constante de equilibrio de disociación (KD) de aproximadamente 10-10 M o menos, o 10-11 M o incluso menos. Tales anticuerpos también incluyen aquellos que no reaccionan de forma cruzada con quimiocinas relacionadas, por ejemplo, GRO-a humana, GRO-º humana, IP-10 o NAP-2 humana, y por tanto, no inhiben su función.

1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une a IL-8 humana que comprende las seis secuencias de CDR VLCDR1 de SEC ID Nº: 16, VLCDR2 de SEC ID Nº: 17, VLCDR3 de SEC ID Nº: 18, VHCDR1 de SEC ID Nº: 22, VHCDR2 de SEC ID Nº: 23 y VH CDR3 de SEC ID Nº: 24.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable como se expone en SEC ID Nº: 12 y/o una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable como se expone en SEC ID Nº: 8.

3. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el anticuerpo se selecciona de un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgA secretora, IgD y IgE.

4. El anticuerpo de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo es un isotipo IgG1, K o IgG1, A.

5. El anticuerpo de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo es un isotipo IgG4, K o IgG4, A.

6. El anticuerpo de la reivindicación 3 ó 4 que comprende una cadena pesada de IgG1 o IgG3.

7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo tiene una o más de las siguientes características:

(i) inhibe la unión de IL-8 a sus receptores (CXCR1 y CXCR2) ;

(ii) inhibe los efectos proinflamatorios inducidos por IL-8;

(iii) inhibe la actividad quimiotáctica inducida por IL-8 para neutrófilos;

(iv) inhibe el flujo de calcio inducido por IL-8;

(v) inhibe los cambios inducidos por IL-8 en los niveles de expresión de moléculas de adhesión o neutrófilos;

(vi) inhibe el aumento de la expresión inducida por IL-8 de CD11b (Mac-1) e inhibe la disminución de la expresión inducida por IL-8 de L-selectina sobre neutrófilos;

(vii) no reacciona de forma cruzada con quimiocinas relacionadas seleccionadas de GRO-a humana, GROº humana, IP-10 humana y NAP-2 humana;

(viii) inhibe significativamente la quimiotaxia inducida por líquidos biológicos que contienen múltiples factores quimiotácticos que incluyen IL-8.

8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que tiene una constante de equilibrio de disociación (KD) de aproximadamente 10-10 M o menos cuando se determina por tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) en un instrumento BIACORE 3000 usando IL-8 recombinante humana como analito y el anticuerpo como ligando.

9. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es un anticuerpo intacto seleccionado de un anticuerpo IgG1 intacto, un anticuerpo IgG2 intacto, un anticuerpo IgG3 intacto, un anticuerpo IgG4 intacto, un anticuerpo IgGM intacto, un anticuerpo IgA1 intacto, un anticuerpo IgA2 intacto, un anticuerpo IgA secretor intacto, un anticuerpo IgD intacto y un anticuerpo IgE intacto, en el que el anticuerpo está glicosilado en una célula eucariota.

10. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo monocatenario.

11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que es una proteína de fusión de dominio de unióninmunoglobulina que comprende:

(i) una región variable de la cadena pesada como se define en la reivindicación 2, una región variable de la cadena ligera como se define en la reivindicación 2 o una región variable de la cadena pesada como se define en la reivindicación 2 fusionada con una región variable de la cadena ligera como se define en la reivindicación 2 por un péptido ligador que está fusionado con un polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina,

(ii) una región constante CH2 de la cadena pesada de la inmunoglobulina fusionada con la región bisagra, y

(iii) una región constante CH3 de la cadena pesada de la inmunoglobulina fusionada con la región constante CH2.

12. Un hibridoma que produce una cantidad detectable del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

13. El hibridoma de la reivindicación 12 que comprende un linfocito B obtenido de un animal no humano transgénico en el que los reordenamientos del segmento del gen V- (D) -J han producido la formación de un transgén de la cadena pesada humana funcional y un transgén de la cadena ligera funcional, fusionado con una célula

inmortalizada.

14. El hibridoma de la reivindicación 12 ó 13, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano codificado por ácidos nucleicos de la cadena pesada de IgG1 humana y de la cadena ligera kappa humana.

15. Un animal no humano transgénico que expresa un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el animal no humano transgénico tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada humana y un transgén de la cadena ligera humana.

16. Un transfectoma, una célula huésped eucariota o procariota o un animal no humano transgénico o planta que comprende ácidos nucleicos que codifican una cadena pesada humana y una cadena ligera humana, o una línea celular tal como una línea celular CHO o NS/0, que produce una cantidad detectable del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

17. Un procedimiento de producción del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que comprende:

inmunizar un animal no humano transgénico que tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada humana y un transgén de la cadena ligera humana con IL-8 humana o una célula que expresa IL-8 humana, de forma que los anticuerpos son producidos por linfocitos B del animal; aislar los linfocitos B del animal; fusionar los linfocitos B con células de mieloma para formar células de hibridoma inmortales que secretan anticuerpos monoclonales humanos que se unen a IL-8 humana; y aislar los anticuerpos monoclonales humanos específicos para IL-8 humana del sobrenadante de cultivo del hibridoma, o de un derivado de transfectoma de tal hibridoma.

18. Una molécula biespecífica o multiespecífica que comprende un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y una especificidad de unión por una célula efectora humana tal como una especificidad de unión por un receptor de Fc receptor tal como un receptor de Fcy humano, por ejemplo, FcyRI, o un receptor de Fca humano, o un receptor de linfocitos T tal como CD3.

19. Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

20. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o el vector de expresión de la reivindicación 19 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Una composición farmacéutica de la reivindicación 20 que comprende además uno o más agentes terapéuticos adicionales.

22. La composición de la reivindicación 21, en el que el uno o más agentes adicionales se seleccionan de agentes para tratar un trastorno inflamatorio o hiperproliferativo de la piel, agentes inmunosupresores, agentes antiinflamatorios y agentes quimioterapéuticos.

23. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, un vector de expresión según la reivindicación 19

o una composición farmacéutica según la reivindicación 20 para su uso en un procedimiento para inhibir efectos proinflamatorios inducidos por IL-8 en un sujeto.

24. Uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, de un vector de expresión según la reivindicación 19 o de una composición farmacéutica según la reivindicación 20 en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno inmunitario, autoinmunitario, inflamatorio o infeccioso mediado por IL-8 humana o que implica actividad de IL-8 humana o para tratar o prevenir cáncer.

25. El uso de la reivindicación 24, en el que el trastorno es:

(i) un trastorno inflamatorio o hiperproliferativo de la piel seleccionado de PPP, psoriasis que incluye psoriasis en placas y psoriasis de tipo gotosa, enfermedades ampollosas de la piel tales como penfigoide ampolloso, dermatitis de contacto, eccema, dermatitis eritematosa y atópica;

(ii) una enfermedad inmunitaria, autoinmunitaria o inflamatoria seleccionada de artritis psoriásica, esclerodermia y esclerosis sistémica, enfermedad inflamatoria del intestino (EII) , enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, lesión pulmonar aguda tal como síndrome disneico agudo o síndrome disneico del adulto, meningitis, encefalitis, uveítis, mieloma múltiple, glomerulonefritis, nefritis, asma, aterosclerosis, deficiencia de adhesión leucocitaria, esclerosis múltiple, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjögren, diabetes juvenil, enfermedad de Reiter, enfermedad de Behcet, nefritis inmunocompleja, nefropatía por IgA, polineuropatías por IgM, trombocitopenias inmunomediadas tales como púrpura trombocitopénica idiopática aguda y púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemolítica, miastenia grave, nefritis lúpica, lupus eritematoso, artritis reumatoide (RA) , espondilitis anquilosante, pénfigo, enfermedad de Graves, tiroiditis de

Hashimoto, vasculitis de vasos pequeños tales como granulomatosis de Wegener, síndrome de Omen, insuficiencia renal crónica, enfermedad tiroidea autoinmune, mononucleosis infecciosa aguda, VIH, enfermedades asociadas al virus del herpes, infecciones por virus humanos tales como resfriado como se produce por rinovirus humano, coronavirus, otros enterovirus, virus del herpes, virus de la gripe, virus paragripal, virus respiratorio sincitial o infección por adenovirus, neumonía bacteriana, heridas, septicemia, infarto cerebral/edema cerebral, lesión por isquemia-reperfusión y hepatitis C; o (iii) se selecciona de angeítis cerebral aislada, mononeuritis múltiple, infarto agudo de miocardio, miocarditis, pericarditis, endocarditis de Liebman-Sacks, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) , alveolitis, bronquiolitis obliterante, fibrosis quística, aspergilosis alérgica, síndrome de Löffler, colangitis esclerosante, cistitis crónica, nefritis tubulointersticial, síndrome respiratorio agudo grave (SRAG) , vasculitis de vasos grandes (incluyendo arteritis de células gigantes, polimialgia reumática y arteritis de Takayasu) , vasculitis de vasos de tamaño medio (incluyendo poliarteritis nodosa, poliarteritis nodosa localizada y enfermedad de Kawasaki) , vasculitis de vasos pequeños (incluyendo síndrome de Churg-Strauss, poliarteritis microscópica, vasculitis crioglobulinémica y angeítis leucocitoclástica) , vasculitis secundaria (incluyendo vasculitis reumatoide y vasculitis asociada a lupus eritematoso sistémico o síndrome de Sjögren) , sacroileítis aislada, el síndrome de SAPHO, discitis (incluyendo discitis posoperatoria) , tiroiditis subaguda, penfigoide cicatricial, dermatitis herpetiforme, dermatosis pustulosa subcorneal, epidermolisis ampollosa adquirida, rosácea, dermatosis febril aguda, granuloma anular (incluyendo síndrome de Sweet) , piodermia gangrenosa, acné (incluyendo acné conglobata) , sarcoidosis, policondritis recurrente, fiebre mediterránea familiar, paniculitis, eritema nodoso, enfermedad de Weber-Christian, fibrosis retroperitoneal, osteoporosis, metástasis osteolíticas, cáncer gástrico, cáncer colorrectal y cáncer de la vejiga urinaria.

26. El uso de la reivindicación 24, en el que el trastorno se selecciona de melanoma, carcinoma tiroideo, carcinoma de células transitorias, triquilemona, carcinoma de células escamosas y cáncer de mama.

27. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en el que dicho procedimiento comprende la administración de uno o más agentes terapéuticos adicionales tales como agentes para tratar un trastorno inflamatorio o hiperproliferativo de la piel, agentes inmunosupresores, agentes antiinflamatorios o agentes quimioterapéuticos y opcionalmente comprende además la exposición a la luz del sol o fototerapia que incluye UVB (ultravioleta B de banda ancha y de banda estrecha) , UVA (ultravioleta A) y PUVA (psoraleno-metoxaleno más ultravioleta A) .

28. El procedimiento de la reivindicación 27, en el que el uno o más agentes adicionales se seleccionan de agentes para tratar un trastorno inflamatorio o hiperproliferativo de la piel seleccionado de medicaciones tópicas, orales o inyectadas.

29. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que:

- la medicación tópica se selecciona de alquitrán de hulla, vitamina A, antralina, calcipotrieno, tarazoteno y corticosteroides; o

- la medicación oral o inyectada se selecciona de corticosteroides, metotrexato, retinoides, ciclosporina, etanercept, alefacept, efalizumab, 6-tioguanina, micofenolato mofetilo, tacrolimus (FK-506) e hidroxiurea.

30. El procedimiento de la reivindicación 29, en el que el retinoide es acitretina.

31. El procedimiento de la reivindicación 27, en el que el uno o más agentes adicionales se seleccionan de agentes que bloquean o interfieren con la función de receptores de quimiocinas CC o CXC, o agentes que bloquean la función de ligandos de quimiocinas.

32. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que el agente que bloquea o interfiere con la función de receptores de quimiocinas CC o CXC se selecciona de un anticuerpo contra o un antagonista natural o sintético de CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2 o CCR5.

33. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que el agente que bloquea la función de ligandos de quimiocinas se selecciona de un anticuerpo para MIP-1a, MIP-1º, RANTES, MCP-1, MCP-2, MCP-3 o MCP-4.

34. Un procedimiento para detectar la presencia de antígeno de IL-8 o una célula que expresa IL-8 en una muestra que comprende:

poner en contacto la muestra, y una muestra de control, con el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo y IL-8, y detectar la formación de un complejo en el que una diferencia en la formación del complejo entre la muestra en comparación con la muestra de control es indicativa la presencia de IL-8 en la muestra.

35. Un kit para detectar la presencia de IL-8, o una célula que produce IL-8, en una muestra que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

36. El kit de la reivindicación 35, que comprende el anticuerpo en forma marcada. 5

37. Un anticuerpo antiidiotípico que se une a un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

38. Uso de un anticuerpo antiidiotípico de la reivindicación 37 para detectar el nivel de anticuerpo monoclonal

humano contra IL-8 en una muestra. 10