PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN DE FACTORES BIOLÓGICOS EN LA EPIDERMIS.

Procedimiento para cuantificar la expresión relativa de un ácido ribonucleico (ARN) de una muestra de piel obtenida mediante la aplicación de una cinta adhesiva a la piel y proceder a la abrasión de la piel para obtener una muestra de la adhesión a la cinta,

en el que el ARN codifica una citocina, que comprende: (a) detectar el ARN que codifica una citocina de la muestra de piel; y (b) comparar el nivel de dicho ARN de la muestra de piel con una muestra de control, cuantificando de este modo la expresión relativa de dicho ARN

Campo técnico 5

La presente invención se refiere a un procedimiento de detección de factores biológicos en la epidermis, en el que el factor biológico puede ser un polinucleótido o polipéptido codificado por el polinucleótido o un lípido.

Antecedentes 10

Las células y los tejidos se ven influidos por agentes endógenos y exógenos y responden con una cascada de actividades biológicas para proporcionar una respuesta a un agente. Por ejemplo, la piel es la zona donde se producen muchas reacciones dermatológicas provocadas por la exposición de la piel a agentes exógenos. La piel es asimismo el órgano más accesible del organismo. Por lo tanto, la propia piel se presta a acceder a la determinación 15 de reacciones proteicas, así como, el / los gen(es) y productos génicos que están asociados con o que dan lugar a una reacción particular.

La epidermis es la capa más externa de la piel. Dicha capa contiene cuatro tipos principales de células. La célula de mayor predominio en la epidermis es el queratinocito en diversas etapas de diferenciación. La epidermis mantiene 20 su grupo de queratinocitos mediante la mitosis de dichas células en la capa celular basal, la capa inferior de la epidermis. En cambio, la capa de recubrimiento superior de la epidermis es la capa córnea que, en la piel normal, no contienen células nucleadas. Los queratinocitos producen una serie de citocinas tales como las interleucinas (IL) IL-I, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 y el factor estimulante de colonias de granulocitos - macrófagos (GM-CSF) Kupper, M., 1993. Am. J Dermatopathol 11: 69-73). Por encima de la capa celular basal, se encuentra el de células 25 de Langerhans, una célula inmunitaria competente que se origina en la médula ósea. La célula de Langerhans presenta características de los macrófagos así como de los linfocitos T y se considera responsable de iniciar una serie de eventos que conducen a reacciones inmunitarias de la piel tales como la dermatitis de contacto. El melanocito es la célula productora de pigmentos de la piel. Dicha se encuentra habitualmente asimismo en las capas más profundas de la epidermis. El cuarto tipo de célula de la epidermis es la célula de Merkel. 30

Inmediatamente debajo de la epidermis, se encuentra la capa dérmica que contiene principalmente fibroblastos, linfocitos, mastocitos, células endoteliales y terminaciones nerviosas. Los fibroblastos son el tipo principal de célula que deposita el material de la matriz extracelular y las proteínas estructurales de la piel, tales como el colágeno. Las células endoteliales recubren las luces de los capilares dérmicos y los mastocitos contienen histamina que se puede 35 liberar en las respuestas inflamatorias de la piel.

La inflamación de la piel puede ser el resultado de una amplia gama de agentes externos aplicados a la piel. Las clases de dermatitis de contacto comprenden mecanismos irritativos, alérgicos, fotoalérgicos y fototóxicas y subclínico. Desde un punto de vista clínico, las reacciones son prácticamente idénticas con la aparición de un 40 proceso eccematoso caracterizado por eritema, edema y vesiculación (Hoefakker et al. 1995 Contact Dermat 33: 258-266; Krasteva, M. 1993 Int. J. Dermatol 32: 547-560). La urticaria de contacto es una respuesta potencial adicional a la aplicación cutánea de diversos agentes que se diferencia en la aparición inmediata de una roncha al entrar en contacto con la piel. Resulta importante para los pacientes categorizar el mecanismo de la reacción de contacto. Ello se debe a las consecuencias inmunológicas de una reacción alérgica o inmunitaria que provoque una 45 inflamación cada vez más grave de la piel con la reexposición tras la sensibilización. Por ejemplo, la caracterización del tipo de respuesta inflamatoria a la exposición de un agente puede permitir tanto a los pacientes como a los fabricantes la posibilidad de adquirir y rediseñar sus productos para evitar futuras reacciones inflamatorias.

La frecuencia y el historial de la dermatitis de contacto han proporcionado el impulso para aplicar las pruebas en la 50 piel humana de todos los nuevos medicamentos tópicos o productos cosmeticéuticos. Se requiere actualmente realizar un gran número de pruebas de seguridad de la piel antes de cualquier producto destinado a entrar en contacto con la piel se pueda comercializar en muchos países. Las pruebas predictivas con parches cutáneos con el producto y sus constituyentes han constituido la base de este procedimiento de prueba. Desde el inicio de estas pruebas predictivas con parche cutáneos, un problema importante ha sido la incapacidad de diferenciar claramente 55 una dermatitis de contacto irritativa (ICD) de una dermatitis de contacto alérgica (ACD). Además, la prueba con parches simplemente no resulta suficiente para determinar cuantitativamente la gravedad de una reacción ya que depende de puntuaciones cualitativas visuales del eritema, el edema y la vesiculación.

Constituye un objetivo de la presente invención superar las limitaciones descritas anteriormente. Por lo tanto, la 60 presente invención proporciona un procedimiento no invasivo para detectar un factor biológico en las células cutáneas por debajo del estrato córneo. La caracterización del factor biológico resulta útil para distinguir las reacciones sistémicas así como las reacciones locales tales como la dermatitis de contacto y, más específicamente, para distinguir la dermatitis de contacto irritativa (ICD) de la dermatitis de contacto alérgica (ACD).

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La presente invención proporciona un procedimiento para cuantificar la expresión relativa de un ácido ribonucleico (ARN) de una muestra de piel obtenida mediante la aplicación de una cinta adhesiva a la piel y proceder a la abrasión de la piel para obtener una muestra adherida a la cinta adhesiva, en la que el ARN codifica una citocina, que comprende:

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(a) detectar el ARN que codifica una citocina de la muestra de piel; y

(b) comparar el nivel de dicho ARN de la muestra de piel con una muestra de control, cuantificando de este modo la expresión relativa de dicho ARN.

Se puede diagnosticar la ICD en un paciente mediante la cuantificación del polinucleótido que codifica la IL-8 en las 10 células del subestrato córneo del paciente, en las que la presencia del ARNm de la IL-8 en una ausencia relativa de IL -4 y IL-13 es indicativa de la ICD.

Se puede diagnosticar la ACD en un paciente mediante la cuantificación del polinucleótido que codifica la IL-4 a partir de células del subestrato córneo del paciente, en las que la presencia del ARNm de la IL-4 es indicativa de la 15 ACD.

Se puede diagnosticar asimismo la ACD detectando la expresión de la IL-13 en un paciente comprendiendo la cuantificación de un polinucleótido que codifica la IL-13 en células cutáneas del paciente, en las que una cantidad elevada del polinucleótido de la IL-13 es indicativa de la ACD. 20

Un kit para obtener muestras de la piel de un modo no invasivo puede comprender una cinta para la recogida de células y una zona intermedia de lisis celular o un chip informático apto para conservar los ácidos nucleicos de la muestra de piel.

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Alternativamente, un kit puede comprender una cinta para la recogida de células y una zona intermedia de lisis celular y un reactivo de detección, tal como un reactivo de hibridación.

Se puede identificar un compuesto que provoca dermatitis mediante el contacto con una sección de la piel con un compuesto de ensayo y, posteriormente, detectar la presencia de un polinucleótido que codifica una citocina o un 30 polipéptido de una citocina, siendo la presencia del polinucleótido indicativa de una dermatitis. El procedimiento se puede realizar in vivo o in vitro, comprendiendo la utilización de constructos cutáneos organotípicos tridimensionales.

Los detalles de una o más formas de realización de la presente invención se establecen en los dibujos adjuntos y la descripción posterior. Otras características, objetivos y ventajas de la presente invención se pondrán claramente de 35 manifiesto a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.

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1. Procedimiento para cuantificar la expresión relativa de un ácido ribonucleico (ARN) de una muestra de piel obtenida mediante la aplicación de una cinta adhesiva a la piel y proceder a la abrasión de la piel para obtener una muestra de la adhesión a la cinta, en el que el ARN codifica una citocina, que comprende: 5

(a) detectar el ARN que codifica una citocina de la muestra de piel; y

(b) comparar el nivel de dicho ARN de la muestra de piel con una muestra de control, cuantificando de este modo la expresión relativa de dicho ARN.

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2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra de piel comprende las células del estrato córneo y las células asociadas al estrato córneo que se han obtenido al aplicar y retirar de la cinta adhesiva.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la detección comprende detectar ARNm.

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4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la detección comprende detectar un ARN que codifica una interleucina.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la detección comprende detectar un ARN que codifica la interleucina-I (IL-I), la interleucina-2 (IL-2), la interleucina-3 (IL-3), la interleucina-4 (IL-4), la interleucina-5 (IL-5), la 20 interleucina-6 (IL-6), la interleucina-8 (IL-8), la interleucina-9 (IL-9), la interleucina-13 (IL-13) y la interleucina-14 ( IL-14), el factor estimulante de colonias de granulocitos - macrófagos (GM-SCF) o un interferón, o cualquier combinación de los mismos.

6. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la detección comprende detectar un ARN que codifica una 25 sustancia que interviene en la inflamación.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cinta adhesiva se aplica a la piel de un paciente afectado por una enfermedad, trastorno o reacción inflamatoria.

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8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la cinta adhesiva se aplica a la piel de un paciente afectado por dermatitis.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cinta adhesiva se aplica a piel que ha puesto en contacto con un agente externo que provoca dermatitis antes de aplicar la cinta. 35

10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra de piel se obtiene de un mamífero.

11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra de piel se obtiene de un ser humano.