DETECCIÓN DE GÉRMENES ASOCIADOS A PERIODONTITIS.

La presente invención describe un procedimiento, un dispositivo microfluídico, así como un kit para la detección y/o para la determinación de bacterias asociadas a periodontitis de una muestra biológica. La periodontitis es una inflamación causada por bacterias y que se manifiesta en una destrucción ampliamente irreversible del aparato de soporte dental (periodoncio). La periodontitis es producida por la placa bacteriana (sarro), una biopelícula resistente adherente. La principal característica distintiva es la descalcificación ósea radiográficamente detectable existente en la periodontitis, mientras que las bolsas gingivales profundizadas en una gingivitis se producen debido a la hinchazón inflamatoria de la encía. Tanto en la gingivitis como también en la periodontitis se liberan productos del metabolismo y de la descomposición bacteriana de la biopelícula que producen reacciones de defensa del cuerpo. El sistema inmunitario autólogo desempeña la función principal en la propia destrucción de tejido que intenta eliminar las bacterias. Esta resistencia inmunológica está constituida por una variada sucesión de reacciones y acciones en las que participan las distintas sustancias y células inflamatorias. Entre otros se forman enzimas que destruirán las bacterias, sin embargo también conducen a una destrucción del tejido autólogo. Esto conduce por último a la pérdida de tejido conjuntivo y huesos. El resultado de la reacción sobre las bacterias son sangrados gingivales, formación de bolsas, retracción de la encía y finalmente aflojamiento y pérdida de los dientes. A partir de los treinta y cinco años los seres humanos pierden más dientes por periodontitis que por caries. Es en gran medida desconocido que la encía enferma también puede cargar gravemente otros órganos. La periodontitis es una enfermedad muy frecuente en la que en el transcurso de los años se daña la encía o el aparato de soporte dental por la falta de higiene bucal. Especialmente sin un tratamiento de la periodontitis existe el riesgo de la pérdida de los dientes. En la mayoría de los casos se trata de un acontecimiento que transcurre de forma crónica. Ésta aparece predominantemente en adultos, sólo es raramente dolorosa y sólo después de años conduce a aflojamientos de los dientes al menos la mayoría de las veces de forma desapercibida para los afectados. Por tanto, el borde gingival ofrece para las bacterias una protección relativa de la cavidad bucal autolimpiante por la lengua y la saliva. En personas sanas, el llamado epitelio del borde garantiza una superficie continua entre la encía y el diente debido a su adhesión al esmalte dental. Si la placa en estos nichos no se elimina cuidadosamente, los productos de secreción de los microorganismos (exotoxinas) atacan el epitelio del borde y algunas bacterias pueden incluso cruzar el epitelio. El cuerpo reacciona a tales ataques con la inmigración de células de defensa de la sangre. Así, poco a poco se destruyen y se fagocitan los intrusos. A este respecto se liberan distintas endotoxinas. Tanto las exotoxinas como también las endotoxinas y algunos productos de descomposición de las células de defensa del cuerpo producen un estímulo. Para proteger el tejido de los alrededores de estos estímulos y prevenir una penetración de la inflamación en la mandíbula, el cuerpo también activa, entre otros, osteoclastos. Su objetivo consiste en la reducción y la conversión específica de tejido óseo. Con unas buenas defensas del cuerpo puede impedirse durante un largo tiempo que los microorganismos penetren en la mandíbula. Sin embargo, las relaciones de fuerza en esta lucha son muy lábiles. Un empeoramiento de las defensas del cuerpo, una fuerte multiplicación de bacterias o un cambio de la agresividad de los microorganismos conduce entonces a otra propagación del acontecimiento de inflamación en la profundidad. Así, en el transcurso se produce una pérdida ósea continua que sólo puede detenerse por una eliminación completa de los estímulos. La pérdida ósea aparece predominantemente horizontalmente en las radiografías ya que los osteoclastos en las fases de reposo de la inflamación transforman el tejido óseo segmentado y así se adaptan a las nuevas circunstancias. Debido al desarrollo lento y largo de la enfermedad, esta forma de inflamación se denomina periodontitis crónica. De ésta se diferencia la periodontitis agresiva, que conduce rápidamente a una extensa pérdida ósea y algunas veces también aparece ya en la infancia. De las aproximadamente 500 especies de bacterias distintas que pueden existir en la cavidad bucal, solo algunas son patógenos periodontales. Éstos también se denominan gérmenes conductores principales y forman las llamadas agrupaciones, que son específicas en su asociación. Son especies de bacterias estrictamente o facultativamente anaerobias, Gram-negativas, pigmentadas de negro como el llamado complejo rojo (Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola y Tannerella forsythensis, así como Actinobacillus actinomycetemcomitans subtipo B). La terapia consiste hoy en día en suprimir el estado de inflamación de la encía y del aparato de soporte dental y suprimir la placa y el sarro, así como los factores promotores de la inflamación. El tratamiento se subdivide en distintas fases en las que pueden tomarse diferentes medidas. La primera fase representa un amplio diagnóstico con el que pueden determinarse el tipo, la gravedad y el desarrollo de la enfermedad. Además de las radiografías todavía 2   sigue una valoración clínica del estado total de la dentadura. Entretanto, en muchos casos se realizan complementariamente pruebas microbiológicas (detección de determinadas bacterias patógenas periodontales). Si la periodontitis está tan fuertemente acentuada que deben administrarse antibióticos es ventajoso realizar previamente una determinación de gérmenes para poderla tratar de forma específica. La periodontitis sin tratar conduce casi siempre a la pérdida de dientes y, como consecuencia de esto, a perjuicios estéticos y funcionales. Además, la periodontitis es un factor de riesgo para las enfermedades médicas en general. Por tanto, se considera científicamente probada una relación entre enfermedades periodontales y el elevado riesgo de aparición de infartos de miocardio y enfermedades del espectro de alteraciones reumáticas. En las últimas investigaciones pudo además mostrarse que una periodontitis sin tratar aumenta siete veces el riesgo de partos prematuros y un bajo peso de nacimiento también puede estar relacionado causalmente con la periodontitis. Por el documento AT 411 174 B se conoce un procedimiento y un kit para el análisis de ácidos nucleicos que se usan para la identificación de bacterias asociadas a periodontitis. Aquí, sobre la superficie de un soporte sobre el que están dispuestos al menos una zona de análisis predefinida y una zona de control predefinida está aplicado un oligonucleótido con una secuencia que es complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos diana. Se aplican oligonucleótidos para la identificación de diversas bacterias asociadas a periodontitis que están constituidos preferiblemente por 10 a 120 nucleótidos. Como soporte se describe un biochip sobre el que se colocan los oligonucleótidos específicos. Antes de ponerse en contacto la muestra biológica con el biochip, el ADN de bacterias existente en la muestra biológica se amplifica mediante secuencias de cebadores específicos. El documento DE 699 24 741 T2 describe una composición para la preparación de un fármaco para la prevención y el tratamiento de periodontitis. A este respecto, la periodontitis se combate eficazmente mediante el uso de un barniz que contiene un principio activo antimicrobiano. Se usa una composición antimicrobiana que comprende una base de barniz transparente fisiológicamente compatible y disuelto en ella un principio activo antimicrobiano. Por el documento DE 101 54 290 A1 también se conoce un procedimiento para la detección de bacterias asociadas a periodontitis y a caries. La invención se refiere especialmente a procedimientos de hibridación y procedimientos de amplificación, así como a procedimientos de amplificación / hibridación acoplados con sondas o cebadores específicos de secuencia. Para la amplificación se usa preferiblemente la reacción en cadena de la polimerasa. En la forma más sencilla de detección del ácido nucleico que va a detectarse, el amplificado, por ejemplo, se corta específicamente mediante digestión con una enzima de restricción y los fragmentos formados se analizan en un gel de agarosa. También están muy extendidos los sistemas de hibridación, teniendo lugar la hibridación normalmente de forma que o bien la composición que contiene el producto de amplificación o una parte del mismo o bien la sonda se inmoviliza... [Seguir leyendo]

1.- Procedimiento para la detección y/o para la determinación de bacterias asociadas a periodontitis de una muestra biológica, que comprende las etapas i) obtención de la muestra biológica, ii) desnaturalización de la muestra biológica, especialmente células, iii) hibridación de la muestra lisada con al menos uno de los oligonucleótidos de SEQ ID Nº 4 o SEQ ID Nº 5 sobre un soporte y iv) detección del resultado. 2.- Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la detección y/o la determinación comprende las etapas de a) transferencia de la muestra biológica a una solución universal que contiene reactivos caotrópicos y al menos el oligonucleótido de SEQ ID Nº 6 en un recipiente, b) desnaturalización de la muestra, especialmente mediante calentamiento del recipiente, c) transferencia de al menos una parte de la solución a o sobre un soporte con al menos un oligonucleótido inmovilizado de SEQ ID Nº 5 y dado el caso adicionalmente de SEQ ID Nº 7, 1 a 3 y/u 8, d) hibridación y dado el caso incubación y e) detección. 3.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque la hibridación se realiza adicionalmente con al menos una sonda, seleccionándose la sonda del grupo que contiene: i) oligonucleótido de SEQ ID Nº 1, 2, 3, 6, 7 u 8, ii) oligonucleótido que presenta una secuencia de nucleótidos mutada en comparación con uno de los oligonucleótidos de SEQ ID Nº 1, 2, 3, 6, 7 u 8, especialmente una adición o deleción de 1 a 10 nucleótidos o una sustitución de 1 a 3 nucleótidos en una de las secuencias de nucleótidos, iii) oligonucleótido que presenta una secuencia de nucleótidos que es complementaria al menos por zonas a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº 1, 2, 3, 6, 7 u 8. 4.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque como soporte se usa un sistema capilar, preferiblemente una tira reactiva o un dispositivo microfluídico. 5.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 ó 4, caracterizado porque el oligonucleótido usado como sonda es una molécula de ADN, ARN, PNA, LNA o una forma mixta de las mismas. 6.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque en la solución universal están contenidas como reactivo caotrópico sales de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, formamida, urea, perclorato, tiocianato, tricloroacetato, nitrato o yoduro, preferiblemente en una concentración de 0,1 M a 10 M. 7.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque en la solución universal se realiza el marcado de la muestra biológica, especialmente mediante el oligonucleótido marcado de SEQ ID Nº 6. 8.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la hibridación se realiza a temperatura ambiente. 9.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la desnaturalización de la muestra se realiza a una temperatura seleccionada de un intervalo con un límite inferior de 50 ºC y un límite superior de 100 ºC. 10.- Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la transferencia de la muestra biológica preferiblemente todavía calentada sobre el dispositivo microfluídico se realiza mediante una pipeta o capilar. 11.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la muestra biológica se aplica sobre el dispositivo microfluídico sin amplificación previamente realizada. 12.- Dispositivo microfluídico para la detección y/o para la determinación de al menos un germen asociado a periodontitis de una muestra biológica que comprende un soporte de al menos una parte de fondo con una superficie y al menos un oligonucleótido o molécula de ácido nucleico unido a la superficie del soporte, caracterizado porque está unido al menos uno de los oligonucleótidos de SEQ ID Nº 4 o SEQ ID Nº 5, así como opcionalmente al menos otro oligonucleótido que se selecciona del grupo que contiene: i) oligonucleótido de SEQ ID Nº 1, 2, 3, 6, 7 u 8, ii) oligonucleótido que presenta una secuencia de nucleótidos mutada en comparación con uno de los oligonucleótidos de SEQ ID Nº 1, 2, 3, 6, 7 u 8, especialmente una adición o deleción de 1 a 10 nucleótidos o una sustitución de 1 a 3 nucleótidos en una de las secuencias de nucleótidos, iii) oligonucleótido que presenta una secuencia de nucleótidos que es complementaria al menos por zonas a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº 1, 2, 3, 6, 7 u 8. 13.- Dispositivo microfluídico según la reivindicación 12, caracterizado porque al menos un oligonucleótido de control, preferiblemente un oligonucleótido de control positivo, negativo, de orientación, de hibridación, de reacción colorimétrica, está dispuesto sobre la superficie del soporte. 14.- Kit para la detección y/o para la determinación de al menos un germen asociado a periodontitis de una muestra biológica que comprende a) al menos un soporte, preferiblemente un dispositivo microfluídico, con al menos un 12   oligonucleótido inmovilizado o una secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID Nº 4 o SEQ ID Nº 5, así como opcionalmente al menos otro oligonucleótido que se selecciona del grupo que contiene: i) oligonucleótido de SEQ ID Nº 1, 2, 3, 6, 7 u 8, ii) oligonucleótido que presenta una secuencia de nucleótidos mutada en comparación con uno de los oligonucleótidos de SEQ ID Nº 1, 2, 3, 6, 7 u 8, especialmente una adición o deleción de 1 a 10 nucleótidos o una sustitución de 1 a 3 nucleótidos en una de las secuencias de nucleótidos, iii) oligonucleótido que presenta una secuencia de nucleótidos que es complementaria al menos por zonas a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº 1, 2, 3, 6, 7 u 8; y b) al menos un recipiente con una solución universal que comprende al menos un reactivo caotrópico, así como al menos un oligonucleótido. 13