Procedimiento de diagnóstico de un cancer por detección de expresión genica anormal en un individuo que comprende determinar en una muestra del individuo la presencia de una conformación cromosómica anormal,

caracterizandose dicha conformación cromosómica anormal por (i) la presencia de una nueva yuxtaposición que no esta presente durante la expresión normal, o (ii) la ausencia de al menos una yuxtaposición que esta presente durante la expresión genica normal, en el que dicha yuxtaposición es de dos regiones separadas de un gen, para asi diagnosticar si el individuo tiene cancer.

Conformaci6n de ADN (estructuras de bucle) en expresi6n genica normal y anormal

Campo de la invencion

La presente invenci6n se refiere a diagn6stico y expresi6n genica.

Antecedentes de la invencion

Los procedimientos existentes de diagn6stico de enfermedad son frecuentemente insatisfactorios debido a que no esta disponible un marcador adecuado para el diagn6stico fidedigno de la enfermedad o para determinar el estado de la enfermedad. Los presentes enfoques incluyen el uso de detecci6n de proteinas, ARNm o anticuerpos.

La literatura cientifica describe la regulaci6n de la transcripci6n genica por el cambio dinamico entre bucles de genes cuasi estables formados por yuxtaposici6n de dos regiones separadas de un gen, tal como marcadores CC (vease Ramadass y col., resumen de p6ster P037, Transcription UK, Imperial College, Londres, 13-15 abril de 2005) .

Compendio de la invencion

La detecci6n de proteinas, ARNm o anticuerpos no es adecuada en muchos casos de diagn6stico ya que la detecci6n de estas moleculas no representa verdaderamente la expresi6n de los genes ligados a la enfermedad. La variaci6n estocastica de niveles de expresi6n de estas moleculas entre celulas individuales es considerablemente alta, mientras que la semivida varia significativamente y podria ser muy baja, por ejemplo, aproximadamente 15 min para el polipeptido del protoncogen c-myc. Ademas, la detecci6n de estas moleculas s6lo sigue etapas posteriores en el orden de expresi6n genica - transcripci6n y traducci6n.

El ajuste conformacional epigenetico del gen para posibles rondas reiniciadas de transcripci6n y expresi6n proporciona una posibilidad de diagn6sticos en una etapa mucho mas temprana de expresi6n genica. Tales estructuras conformacionales tambien parecen ser estables, es decir, teniendo una alta semivida, que hace que sean mas faciles de detectar.

Los inventores han encontrado que el analisis de la conformaci6n cromos6mica en ADN gen6mico puede usarse para diagn6stico de enfermedad. La conformaci6n se forma por la asociaci6n o yuxtaposici6n de sitios distantes o no adyacentes en el gen. Los sitios pueden ser marcadores CC (que se tratan adicionalmente mas adelante) . Se ha encontrado que un cambio en la conformaci6n cromos6mica de diferentes genes produce un cambio en la expresi6n de los genes y, por tanto, la detecci6n de la conformaci6n especifica puede usarse para detectar expresi6n anormal de un gen.

Por consiguiente, la invenci6n proporciona un procedimiento de detecci6n o diagn6stico de cancer mediante la detecci6n de expresi6n genica anormal en un individuo que comprende determinar en una muestra del individuo la presencia o ausencia de una estructura cromos6mica anormal en la que dos regiones separadas del gen se hayan puesto en estrecha proximidad por yuxtaposici6n, para asi detectar o diagnosticar si el individuo tiene expresi6n genica anormal y, por tanto, cancer.

Descripcion de los dibujos

La Fig. 1 muestra la identificaci6n de los marcadores para las unidades transcripcionales de ARNPII por el algoritmo de reconocimiento de patrones. (A) Esquema para formar y probar el modelo de marcador. 422 genes humanos anotados se muestrean, se prueban y se retroalimentan durante 103 ciclos hasta que se desarrolle un modelo convergente. En los 3' de los genes, la secuencia consenso incluy6 una senal previamente desconocida de patr6n multiplex, Checkpoint Charlie, junto con la senal de poli (A) bien definida y sitios consenso ricos en U. (B) En el extremo 3' del gen beta-globina humano, el marcador CC (marcado con distribuci6n gaussiana) esta presente en la direcci6n 3' del sitio rico en U y se corresponde con el sitio CoTC descrito mas adelante. La grafica muestra una caida en el valor de energia (marcado de gris) en el sitio CC/CoTC en relaci6n con su secuencia vecina. (C) En el cromosoma X en D. melanogaster, el marcador CC (distribuci6n gaussiana) coincide con el aislador gypsy dentro de la banda 7B2. La densidad de predicciones de CC establece una correlaci6n con sitios de uni6n a Su (Hw) . Estudios anteriores muestran elementos gypsy en la banda cromos6mica 7B2 y 7B8 yuxtapuestas con formaci6n de bucle alrededor del locus cut.

La Fig. 2 muestra expresi6n regulada de los genes modelo. (A) La transcripci6n del gen hDHFR esta regulada en los promotores principal y secundario en un modo dependiente del ciclo celular. En celulas quiescentes, un transcrito corto se inicia a partir del promotor secundario en la direcci6n 5'. La citometria de flujo activada por fluorescencia (FACS) de celulas U20S se usa en los experimentos, cultivadas en presencia de 10% de SBF (1) y bajo inhibici6n de contacto en presencia de 0, 5% de SBF. El porcentaje de celulas G0, G2/M, S y G1 bajo cada condici6n se muestra en los diagramas. De acuerdo con informes previos, la transferencia Northern confirma la acumulaci6n de ARNm de DHFR en celulas proliferantes (carril 3) con respecto a celulas quiescentes (carril 4) . Analisis por RT-PCR en tiempo real de transcritos iniciados a partir del promotor secundario en celulas proliferantes (carril 5) y quiescentes (carril 6) . Los valores mostrados se calculan a partir de tres experimentos independientes. (B) Los transcritos hCALCRL de longitud completa s6lo se producen en celulas endoteliales (HMVEC, carril 1) y no en celulas no endoteliales (HEK293T, carril 2) . Los transcritos no codificantes cortos estan presentes en ambos tipos de celulas como se detecta por RACE en 3' desde el primer ex6n (carril 3, celulas endoteliales y carril 4, celulas no endoteliales) . La inmunoquimica confirma que la expresi6n del receptor esta limitada in vivo a celulas endoteliales (flechas negras) y no epiteliales o del estroma (flechas blancas) .

La Fig. 3 muestra propiedades de terminaci6n de los marcadores CC. (A) El gen DHFR humano contiene tres marcadores CC (triangulos s6lidos) . Las propiedades de terminaci6n de la transcripci6n de los marcadores se ensayaron por RT-PCR como se representa en el esquema. Los cebadores inversos (B, C) preceden o siguen la posici6n del marcador CC probado. La RT-PCR para CCDHFR-2 se ensay6 en celulas quiescentes, ya que CCDHFR-2 mostr6 propiedades de terminaci6n reguladas s6lo bajo esas condiciones. Los perfiles para energia libre de plegamiento usando el algoritmo de Zuker muestran una caida en el valor (subrayado en gris) para los tres marcadores CC. (B) La estructura del gen CALCRL humano incluye tres marcadores CC (triangulos s6lidos) . Los marcadores CC en hCALCRL (CCCALCRL-1, CCCALCRL-2 y CCCALCRL-3) tambien muestran una posible terminaci6n de la transcripci6n. Una RACE en 5' desde el primer ex6n confirma que todos los transcritos se originan en la direcci6n 3' de CCCALCRL-1, con cualquier posible transcrito intergenico satisfactoriamente terminado. La prueba de la transcripci6n terminada en CCCALCRL-2 y CCCALCRL-3 se confirm6 por RACE en 3'. El numero de accesos para los transcritos de RACE se presentan entre parentesis. En el panel inferior, las graficas muestran una caida en la energia libre de plegamiento (subrayado en gris) para cada uno de los marcadores CC de hCALCRL.

La Fig. 4 muestra las propiedades de conformaci6n cromos6mica de marcadores CC. (A) El ensayo 3C integrado se realiz6 para los sitios CC en el gen hDHFR bajo condiciones proliferantes y quiescentes. Los controles indican dependencia completa del ensayo en la reticulaci6n, restricci6n, ligaci6n, PCR y enriquecimiento de ARNPII por inmunoprecipitaci6n. En celulas proliferantes se detecta una proximidad espacial entre CCDHFR-1 y CCDHFR-3 (carril 1+3) , pero no entre los sitios CCDHFR-1 y CCDHFR-2 (carril 1+2) dentro del gen hDHFR. En celulas quiescentes, la proximidad espacial tambien se detecta entre los sitios CCDHFR-1 y CCDHFR-2 (carril 1+2) . Ilustraci6n esquematica de posibles conformaciones detectadas por el ensayo 3C bajo condiciones probadas. (B) El ensayo 3C integrado se realiz6 para los sitios CC en el gen hCALCRL en lineas de celulas endoteliales y no endoteliales. Los controles indican dependencia completa del ensayo en la reticulaci6n, restricci6n, ligaci6n, PCR y enriquecimiento por inmunoprecipitaci6n. En celulas endoteliales se detect6 una interacci6n entre CCCALCRL-1, CCCALCRL-2 y CCCALCRL-3 que indica una conformaci6n que yuxtapone todos los marcadores (carriles 1+2 y 1+3, vease el esquema) . En celulas no endoteliales s6lo pudo detectarse una interacci6n entre CCCALCRL-1 y CCCALCRL-2 (carril 1+2, vease el esquema) , siendo la interacci6n entre CCCALCRL-1 y CCCALCRL-3 unica para la transcripci6n productiva de longitud completa en celulas endoteliales.

La Fig. 5 muestra las predicciones de Checkpoint Charlie en otros organismos. El modelo... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de diagn6stico de un cancer por detecci6n de expresi6n genica anormal en un individuo que comprende determinar en una muestra del individuo la presencia de una conformaci6n cromos6mica anormal, caracterizandose dicha conformaci6n cromos6mica anormal por

(i) la presencia de una nueva yuxtaposici6n que no esta presente durante la expresi6n normal, o

(ii) la ausencia de al menos una yuxtaposici6n que esta presente durante la expresi6n genica normal,

en el que dicha yuxtaposici6n es de dos regiones separadas de un gen, para asi diagnosticar si el individuo tiene cancer.

2. Procedimiento segun la reivindicaci6n 1 en el que dicha conformaci6n cromos6mica es un bucle o una estructura topol6gicamente cerrada.

3. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dos o mas genes que participan en cancer se analizan para permitir el diagn6stico del tipo de cancer y/o al menos uno de los genes que se analiza es un gen especifico de tejido que permite que se identifique el tejido en el que se produce la expresi6n anormal.

4. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende detectar la conformaci6n cromos6mica por determinaci6n de si las secuencias en el gen se han puesto en yuxtaposici6n o no por la asociaci6n de marcadores CC en el gen, y/o en el que la yuxtaposici6n se detecta por:

- reticulaci6n de AND yuxtapuesto, seguido de -detecci6n del ADN reticulado, opcionalmente por medio de un procedimiento de detecci6n basado en

secuencias, en el que dichos marcadores CC tienen 5 a 30 nucle6tidos de longitud.

5. Procedimiento segun la reivindicaci6n 4, en el que despues de reticularse el ADN, -el ADN reticulado se somete a digesti6n por restricci6n, -la estructura digerida se somete a ligaci6n, y -la estructura ligada se analiza/detecta.

6. Procedimiento segun la reivindicaci6n 5, en el que el analisis de la estructura ligada comprende la detecci6n de una secuencia de ADN presente en la estructura ligada que no esta presente en el gen.

7. Procedimiento segun la reivindicaci6n 6, en el que la secuencia de ADN presente en la estructura ligada se detecta por secuenciaci6n o por PCR, en el que opcionalmente la presencia de la secuencia ligada se detecta usando una reacci6n de PCR en la que los cebadores forman satisfactoriamente un producto de PCR usando la secuencia ligada como molde, pero no amplifican la secuencia del gen bajo las mismas condiciones de PCR.