MÉTODO DE DIAGNÓSTICO Y DE SEGUIMIENTO DE UNA VAGINOSIS BACTERIANA MEDIANTE CUANTIFICACIÓN MOLECULAR.

Método de diagnóstico y de seguimiento de una vaginosis bacteriana mediante cuantificación molecular. La presente invención se refiere a un método de diagnóstico y de seguimiento in vitro del estado de la flora bacteriana vaginal frente a la presencia de una vaginosis bacteriana (VB) o de su evolución, llegado el caso para el seguimiento de su asistencia terapéutica. Las técnicas actuales de diagnóstico de la VB, que es una infección frecuente con unas consecuencias nefastas para el embarazo, se basan en unos criterios que son poco fiables. Algunas bacterias han sido descritas como asociadas a esta enfermedad, sin haberse beneficiado jamás de una calificación y de una cuantificación molecular fiable. Durante mucho tiempo, la VB se ha definido desde el punto de vista microbiológico por una casi desaparición de la flora vaginal normal compuesta principalmente por lactobacilos en beneficio de otras bacterias, en particular Gardnerella vaginalis, Mobiluncus spp. y micoplasmas genitales [Spiegel CA, CMR 1991 ; Thorsen P, AJGO 1998]. La VB es un motivo frecuente de consulta médica, estando implicada en particular en la susceptibilidad a las infecciones sexualmente transmisibles tales como el VIH, y para los embarazos en la premadurez y el nacimiento de niños de bajo peso. Su prevalencia en la mujer, incluyendo durante el embarazo, se sitúa entre 8 y 23% [Guise JM, AJPM 2001] según los métodos actuales de investigación. Sin embargo, el repaso de la bibliografía es divergente en cuanto al impacto de la asistencia terapéutica de esta patología. En efecto, los primeros estudios, que habían demostrado una reducción del riesgo de parto prematuro durante el tratamiento de la VB, no han podido ser confirmados [Morales HJ, AJOG 1994; Hauth JC, NEJM 1995; Guise JM, AJPM 2001; McDonald H, CDSR 2005; Varma R, EJOGRB 2006; Okun N, OG, 2005; Leitich H, AJOG 2003; Guerra B, EJOGRB 2006]. El objetivo inicial de la presente invención era evaluar el impacto de la VB durante el embarazo así como la eficacia de la asistencia terapéutica de la VB durante el embarazo. Pero, para ello, no estaba disponible ninguna herramienta de diagnóstico. En efecto, el estudio de la bibliografía revela una gran confusión en lo que se refiere a la asistencia terapéutica de la VB relacionada principalmente con la ausencia de herramienta racional para el diagnóstico y el seguimiento de esta patología. Actualmente, las dos herramientas de diagnóstico disponibles son la puntuación de Nugent y los criterios de Amsel. La puntuación de Nugent es el método más mencionado habitualmente en la bibliografía, considerado por algunos como la técnica de referencia, incluso si no se realiza en rutina en los laboratorios de microbiología clínica debido a su carácter fastidioso de su realización [Fredricks DN, NEJM 2005; Thomason JL, AJOG 1992; Ison CA, STD 2002; Nugent RP, JCM 1991]. La puntuación de Nugent identifica la VB gracias a un análisis morfológico semi-cuantitativo de las bacterias después de la coloración de Gram. Por lo tanto, es una técnica subjetiva cuya reproducibilidad ha sido cuestionada [Sha BE, JCM 2005; Schwebke JR, OG 1996]. Los criterios clínicos de Amsel (pH vaginal superior a 4,5; leucorreas grisáceas homogéneas adherentes; olor nitrogenado después de la adición de KOH al 10%; presencia de clue-cells) representan el segundo enfoque de diagnóstico [Amsel R AJM 1983]. Al igual que la puntuación de Nugent, es de determinación delicada y no se utiliza en la práctica clínica habitual. Uno de los límites más peyorativos de estos métodos diagnósticos es la ausencia de identificación de ciertos microorganismos implicados en la VB. Por un lado, la ausencia de pared de los micoplasmas no permite sus identificaciones mediante la coloración de Gram y por lo tanto sus cotizaciones mediante la puntuación de Nugent. Por otro lado, la aportación de la biología molecular ha permitido identificar nuevas bacterias que pueden estar implicadas en la VB pero su demostración mediante los 2 métodos diagnósticos existentes es imposible. Atopobium vaginae es la principal nueva especie bacteriana caracterizada. Su presencia se correlaciona con la VB en algunos artículos sin por ello se haya realizado una apreciación cuantitativa fiable de su sitio relativo con respecto a los demás microorganismos [Bradshaw CS, JID 2006, Rodriguez JM, IJSB 1999; Ferris MJ, BMCID 2004; Ferris MJ, JCM 2004; Verhelst R, BMCM 2004]. En el artículo publicado recientemente por Bradshaw et al. [Bradshaw CS, JID 2006], se describe en particular una relación entre la detección de las bacterias A. vaginae y G. vaginalis y la VB, pero estos resultados son insuficientes para realizar un diagnóstico de VB y/o un seguimiento de la evolución de una VB fiables. En efecto, los datos presentados en este estudio permiten la detección de dichas bacterias pero no su cuantificación real. Además, esta detección ha mostrado una buena sensibilidad, siendo A. vaginae y G. vaginalis detectadas respectivamente en 96% y 99% de los pacientes que padecen VB. Sin embargo, su especificidad es mala puesto que A. vaginae se detecta en 12% de los pacientes que presentan una flora normal y G. vaginalis en 60%. Los autores han intentado entonces un enfoque denominado "semi-cuantitativo" clasificando las cargas bacterianas como bajas o elevadas mediante la comparación de los CT ("Cycle Treshold") medianos de detección de los microorganismos en el seno de todas las muestras analizadas. Así, los autores han estimado una carga mediana de 4 x 10 5 copias para G. vaginalis (mediana que corresponde a 21 ciclos) y 4 x 10 6 copias para A. vaginae (mediana 2 E07866534 04-11-2011   de 18 ciclos). Las cargas elevadas de G. vaginalis (>4 x 10 5 ) y de A. vaginae (>4 x 10 6 ) estaban significativamente más presentes en los pacientes que presentan una VB con respecto a los pacientes con una flora normal. Sin embargo, estos valores presentaban una mala sensibilidad, siendo A. vaginae y G. vaginalis solamente detectadas respectivamente en 49% y 71% de los pacientes que padecen VB (tabla 1). Además, 16 pacientes (28%) con una recaída de VB después del tratamiento presentaban una concentración en G. vaginalis por debajo del umbral determinado (tabla 3). Cuarenta pacientes (70%) con una recaída de VB presentaban asimismo una concentración por debajo del umbral en A. vaginae. El enfoque "semi-cuantitativo" de los autores no se puede aplicar por lo tanto como herramienta de diagnóstico y de seguimiento inmediato de los pacientes. De hecho, las técnicas utilizadas para obtener estos resultados eran insuficientes en varios puntos. En primer lugar, las técnicas de PCR no eran suficientemente sensibles puesto que las dianas moleculares amplificaban fragmentos demasiado largos (fragmento del ARN 16S ribosómico de 430 pares de bases para A. vaginae y de 291 pares de bases para G. vaginalis). En la actualidad, se establece que con una secuencia determinada durante una reacción de PCR tan larga, la sensibilidad es baja. Además, las técnicas de PCR en tiempo real utilizaban para la detección y la cuantificación un marcado en SybrGreen del producto de amplificación, método mucho menos específico que los que utilizan unas sondas de hidrólisis marcadas que necesitan una triple especificidad (dos cebadores más la sonda, para amplificar un fragmento cuyo tamaño no excede 120 pares de bases). Las cuantificaciones se efectúan aparentemente con un estándar variable y no en función de una gama plasmídica estable, reproducible y comparable a lo largo del tiempo. Por último, no se beneficiaban de una herramienta de control cuantitativo que permite juzgar la calidad de sus extracciones. En efecto, buscaba solamente la presencia de ß-globina humana en las muestras sin cuantificarla. Por lo tanto, es muy difícil comparar cuantitativamente las muestras entre sí puesto que la variación de la cantidad de bacterias puede estar relacionada con una variación cualitativa y cuantitativa de secreciones vaginales extraídas. La evaluación de la asistencia terapéutica de las VB no puede por lo tanto librarse de la implementación previa de una herramienta fiable adaptada al diagnóstico de la VB y al seguimiento cualitativo y cuantitativo de la flora vaginal. El objetivo de la presente invención es proporcionar un método de diagnóstico y de seguimiento de la VB al mismo tiempo más fiable, más preciso y más simple de realizar en rutina en los laboratorios de análisis microbiológico clínico. Para ello, los inventores han estudiado las extracciones vaginales de 204 mujeres embarazadas, y han buscado la presencia de cada microorganismo implicado en la VB, desarrollando un método de PCR en tiempo real que permite la detección del ADN específico de las bacterias y la determinación de la carga bacteriana por medio de una gama plasmídica establecida gracias a la construcción... [Seguir leyendo]

1. Método de diagnóstico y de seguimiento in vitro del estado de la flora bacteriana vaginal frente a la presencia de una vaginosis bacteriana y, llegado el caso, para el seguimiento de su tratamiento terapéutico, caracterizado porque - 1/ se cuantifican las concentraciones de bacterias Atopobium vaginae y Gardnerella vaginalis * determinando las concentraciones de secuencias específicas de dichas bacterias Atopobium vaginae y Gardnerella vaginalis presentes en una sola copia en el ADN de dichas bacterias Atopobium vaginae y Gardnerella vaginalis respectivamente, y de una secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica que contiene unas células humanas, en el ADN extraído de una muestra de secreción vaginal de paciente, presentando dichas secuencias específicas un tamaño inferior a 150 nucleótidos, * mediante co-amplificación enzimática de tipo PCR de dichas secuencias específicas contenidas, por un lado, en dicho ADN extraído de la muestra y, por otro lado, en unas muestras de fragmentos de ADN sintéticos que comprenden cada una de dichas secuencias específicas dichas bacterias y dicha secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica de células humanas, sirviendo dichas muestras de estándar de calibrado de cuantificación del ADN, * realizándose la detección y la cuantificación de dichos fragmentos con la ayuda de sondas marcadas de secuencias distintas de las de los cebadores de amplificación para cada una de dichas secuencias específicas de dichas bacterias Atopobium vaginae y Gardnerella vaginalis y dicha secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica que contiene unas células humanas, * siendo dichas secuencias específicas de dichas bacterias las secuencias siguientes, que incluyen unas secuencias de dichas sondas (subrayadas) flanqueadas por unas secuencias de dichos cebadores (en negrita) o sus secuencias complementarias: - para Atopobium vaginae: - para Gardnerella vaginalis: - 2/ se determina la presencia de una vaginosis bacteriana o el fracaso del tratamiento terapéutico en curso, con un valor predictivo positivo de por lo menos 95% y un valor predictivo negativo de por lo menos 99%, si las concentraciones de fragmentos de ADN de las dos secuencias específicas de las bacterias Atopobium vaginae y respectivamente Gardnerella vaginalis en una muestra de extracción de secreciones vaginales de paciente que contiene por lo menos 10 4 células humanas/ml, son tales que se respeta una por lo menos de las 2 condiciones a) y b) siguientes: a) la concentración Ca en dicho fragmento de ADN de Atopobium vaginae es superior o igual a 10 8 copias/ml, y b) la concentración Cg en dicho fragmento de ADN de Gardnerella vaginalis es superior o igual a 10 9 copias/ml. 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque: - a/ en la etapa 1/, se cuantifican además las bacterias Lactobacillus sp. que comprenden por lo menos las bacterias Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jenseneii, Lactobacillus gasseri y Lactobacillus iners, * determinando además la concentración de una secuencia específica de dichas bacterias Lactobacillus sp., estando dicha secuencia específica de los Lactobacillus sp. presente en una sola copia en el ADN de dichas bacterias Lactobacillus sp., y siendo de tamaño inferior a 150 nucleótidos, 31 E07866534 04-11-2011 y   * mediante co-amplificación enzimática de tipo PCR adicional de dicha secuencia específica de las bacterias Lactobacillus sp. contenida, por un lado, en dicho ADN extraído de la muestra y, por otro lado, en una muestra de fragmentos de ADN sintético que comprende, además, dicha secuencia específica de dichas bacterias Lactobacillus sp., comprendiendo dicho fragmento de ADN sintético dicha secuencia específica de dichas bacterias Lactobacillus sp. que sirven de estándar de calibración de cuantificación, * siendo la detección y la cuantificación de dichos fragmentos realizadas con la ayuda de sondas marcadas de secuencias distintas de las de los cebadores de amplificación para cada una de dichas secuencias específicas de dichas bacterias Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis, Lactobacillus sp. y dicha secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica que contiene unas células humanas, y - b/ en la etapa 2/, se determina una vaginosis bacteriana si, además, la concentración Cl en fragmento de ADN específico de dichas bacterias Lactobacillus sp. es inferior o igual a 10 8 copias/ml, preferentemente inferior o igual a 10 7 copias/ml. 3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque se determina una vaginosis bacteriana si dichas concentraciones son tales que se respetan las 3 condiciones siguientes: a- concentración Ca en dicho fragmento de ADN de secuencia específica de Atopobium vaginae es superior o igual a 10 8 copias/ml, b- concentración Cg en dicho fragmento de ADN de secuencia específica de Gardnerella vaginalis es superior o igual a 10 9 copias/ml, y c- concentración Cl en dicho fragmento de ADN de secuencia específica de Lactobacillus sp. es inferior o igual a 10 7 copias/ml. 4. Método según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se realizan unas reacciones de amplificación y de cuantificación mediante PCR en tiempo real, utilizando unas sondas de hidrólisis específicas respectivamente de cada una de dichas secuencias específicas de dichas bacterias y secuencia específica de un gen humano presente en cualquier extracción biológica que contiene unas células humanas, en la muestra a ensayar. 5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque dichas secuencias específicas presentan un tamaño de 70 a 150 nucleótidos, preferentemente de 90 a 120 nucleótidos. 6. Método según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se utiliza un gran fragmento sintético de ADN que sirve de estándar de calibrado de cuantificación del ADN, agrupando dicho gran fragmento de ADN sintético dichas secuencias específicas respectivamente de cada una de dichas bacterias cuyas concentraciones son cuantificadas, y dicha secuencia de ADN humano específico de células humanas. 7. Método según la reivindicación 1 a 6, caracterizado porque dichas secuencias específicas de dichas bacterias comprenden para la bacteria Lactobacillus sp., una secuencia común a las bacterias Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus iners y Lactobacillus acidophilus en el seno del gen tuf que codifica para el factor de elongación en las posiciones 253 a 343 del gen de referencia Genebank AY 562191.1. 8. Método según la reivindicación 7, caracterizado porque dicha secuencia específica para Lactobacillus sp. es la secuencia siguiente que incluye una sonda (subrayada) flanqueada por unas secuencias de dichos cebadores (en negrita) o sus secuencias complementarias: 9. Método según una de las reivindicaciones 6 y 8, caracterizado porque dicho gran fragmento de ADN comprende, como secuencia específica de ADN humano en la muestra a ensayar, una secuencia específica de la albúmina. 10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque dicha secuencia específica de ADN humano en la muestra a ensayar comprende el fragmento de las posiciones 16283-16423 del exón 12 del gen de la albúmina humana de referencia Genebank M12523.1 de secuencia del listado de secuencias siguiente o la secuencia complementaria: 32 E07866534 04-11-2011   11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque dicha secuencia específica de ADN humano en la muestra a ensayar comprende el fragmento de las posiciones 16283-16423 del exón 12 del gen de la albúmina humana de referencia Genebank M12523.1 modificada mediante inserción de un sitio de escisión, en particular el sitio Xhol (secuencia entre paréntesis), fuera de las secuencias que corresponden a los cebadores (secuencias en negrita) y secuencia sonda (secuencia subrayada) de secuencia del listado de secuencias siguiente o la secuencia complementaria: 12. Método según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se utilizan los juegos de cebadores y de sondas seleccionados, llegado el caso, de entre las secuencias siguientes del listado de secuencias o respectivamente sus secuencias complementarias: - para Atopobium vaginae: Cebador 5': Sec. n° 5 = 5'-CCCTATCCGCTCCTGATACC-3' Cebador 3': Sec. n° 6 = 5'-CCAAATATCTGCGCATTTCA-3' Sonda: Sec. n° 7 = 5'-GCAGGCTTGAGTCTGGTAGGGGA-3' - para Gardnerella vaginalis: Cebador 5': Sec. n° 8 = 5'-CGCATCTGCTAAGGATGTTG-3' Cebador 3': Sec. n° 9 = 5'-CAGCAATCTTTTCGCCAACT-3' Sonda: Sec. n° 10 = 5'-TGCAACTATTTCTGCAGCAGATCC-3' - para Lactobacillus sp.: Cebador 5':Sec. n° 11 = 5'-TACATCCCAACTCCAGAACG-3' Cebador 3': Sec. n° 12 = 5'-AAGCAACAGTACCCACGACCA-3' Sonda: Sec. n° 13 = 5'-TGACAAGCCATTCTTAATGCA-3', - para la albúmina humana: Cebador 5': Sec. n° 14 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3' Cebador 3': Sec. n° 15 = 3'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3' Sonda: Sec. n° 16 = 5'-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-3' 13. Método según una de las reivindicaciones 6 a 12, caracterizado porque dicho gran fragmento de ADN sintético constitutivo del ADN de la muestra estándar de calibrado de la cuantificación se inserta en un plásmido. 14. Estuche de diagnóstico útil para la realización de un método según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque comprende - unas muestras de ADN estándar de calibrado que comprende dichas secuencias específicas de cada una de dichas bacterias tales como las definidas en una de las reivindicaciones 1, 5, 7 y 8, preferentemente dicha secuencia específica del ADN humano tal como la definida en las reivindicaciones 1, 9, 10 y 11 y, más preferentemente, dicho gran fragmento de ADN sintético tal como el definido en las reivindicaciones 6 y 13, así como - dichos juegos de cebadores específicos de dichos fragmentos de ADN sintéticos modificados específicos de dichas bacterias y más preferentemente, dichas sondas tales como las definidas en una de las reivindicaciones 1, 4, 8 y 12, y - unos agentes reactivos de realización de una reacción de amplificación de ADN de tipo PCR. 33 E07866534 04-11-2011   34 E07866534 04-11-2011   E07866534 04-11-2011   36 E07866534 04-11-2011