Un polipéptido de fusión que comprende (A)x-M-(A')y, donde A es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo para un receptor Tie diana,

A' es un dominio fibrinógeno de un ligando del receptor Tie o uno de sus fragmentos y es capaz de unirse al mismo receptor diana, M es un componente multimerizante, y X e Y son independientemente un número entre 1 y 10; y donde el polipéptido de fusión activa el receptor Tie diana induciendo la fosforilación de dicho receptor en su unión a él

Campo de la Invención

Esta invención se refiere a proteínas de fusión multiméricas capaces de activar un receptor Tie diana, a los métodos para producir tales polipéptidos de fusión, y a los métodos para tratar, diagnosticar, o controlar enfermedades o afecciones en las cuales se desea la activación del receptor diana.

Descripción de la Técnica Relacionada

La agrupación de dominios del ligando Eph soluble para crear multímeros capaces de activar sus receptores cognados se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.747.033. La Patente de los Estados Unidos Núm.

6.319.499 cita un método de activación de un receptor de eritropoyetina con un anticuerpo. Davis et al. (Nature Structural Biology, Vol. 10, Núm. 1, Enero 2003) describen multímeros de angiopoyetina, que es un ligando del receptor Tie 2, junto con un fragmento Fc de un componente multimerizante. En el documento WO 01/90192 se describe un anticuerpo biespecífico, siendo cada anticuerpo específico para un receptor diana (Tek o Tie-2).

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona polipéptidos de fusión multiméricos capaces de activar un receptor Tie diana que requiere la multimerización para ser activado. Los polipéptidos de la invención son útiles por tratar afecciones en las que es deseable la activación de un receptor diana, así como por tener una variedad de usos diagnósticos y pronósticos in vitro e in vivo. Los polipéptidos de la invención pueden ser tetrámeros monoespecíficos o biespecíficos que muestran una capacidad mejorada para activar un receptor diana, por ejemplo, con respecto a, un anticuerpo específico de la diana o al ligando natural.

Por consiguiente, la invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende (A)X-M-(A')y, donde A es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo para un receptor Tie diana, A' es un dominio de fibrinógeno de un ligando del receptor Tie o uno de sus fragmentos y es capaz de unirse al mismo receptor diana, M es un componente multimerizante, y X e Y son independientemente un número entre 1 y 10; y donde el polipéptido de fusión activa el receptor Tie diana induciendo la fosforilación de dicho receptor al unirse a él.

En una realización preferida, M es el dominio Fc de la IgG o la cadena pesada de la IgG. El dominio Fc de la IgG se puede seleccionar a partir de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, así como cualquier alotipo de cada grupo de isotipos.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido de fusión dimérico activador que comprende dos polipéptidos de fusión de la invención, p. ej., un dímero formado a partir de dos polipéptidos de (A)x-M-(A')y como se ha definido antes. Los dímeros activadores de la invención son capaces de unir y agrupar cuatro o más receptores, conduciendo a la activación del receptor, en comparación con la capacidad de un anticuerpo para agrupar no más de dos receptores.

En una realización, los componentes de los polipéptidos de fusión de la invención están conectados directamente entre sí. En otras realizaciones, se puede incluir una secuencia espaciadora entre uno o más componentes, que pueden comprender una o más moléculas, tales como aminoácidos. Por ejemplo, una secuencia espaciadora puede incluir uno o más aminoácidos conectados naturalmente a un componente que contiene un dominio. Una secuencia espaciadora también puede incluir una secuencia utilizada para intensificar la expresión del polipéptido de fusión, proporcionar sitios de restricción, permitir que los dominios del componente formen estructuras terciarias y cuaternarias óptimas y/o intensifiquen la interacción de un componente con su receptor diana. En una realización, el polipéptido de fusión de la invención comprende una o más secuencias de péptidos entre uno o más componentes que tiene (tienen) entre 1 y 25 aminoácidos. Otras realizaciones pueden incluir una secuencia señal al principio o en el extremo amino de un polipéptido de fusión de la invención. Dicha secuencia señal puede ser nativa con respecto a la célula, recombinante, o sintética.

Los componentes del polipéptido de fusión de la invención se pueden disponer en una variedad de configuraciones. Por ejemplo, descritas desde el comienzo o el extremo amino del polipéptido de fusión, (A)x-M-(A')y, (A)x-(A')y-M, M(A)x-(A')y, (A')y-M-(A)x, (A')y-(A)x-M, M-(A')y-(A)x, (A)x-M-(A')y, (A)x(A')y-M, M-(A)x-(A')y, etc., donde X = 1-10 e Y = 1-10. En una realización aún más específica, X = 1, e Y = 1 o X = 2 e Y = 2.

En un aspecto adicional, la invención ofrece un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención. La invención ofrece adicionalmente un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de la invención, donde la molécula de ácido nucleico está conectada operablemente a una secuencia de control de la expresión. También se proporciona un sistema anfitrión-vector para la producción de los polipéptidos de fusión de la invención que comprende el vector de expresión de la invención que ha sido introducido en una célula anfitriona aislada u organismo no humano, incluyendo, pero no limitado a, animales transgénicos no humanos, adecuados para la expresión de los polipéptidos de fusión.

**(Ver fórmula)**

En un aspecto adicional, la invención ofrece un método para producir un polipéptido de fusión de la invención, que comprende cultivar una célula anfitriona transfectada con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención, en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido a partir de la célula anfitriona, y recuperar el polipéptido de fusión producido de ese modo.

En un aspecto adicional, la invención también hace referencia a métodos terapéuticos para el tratamiento de una enfermedad o afección relacionada con el receptor diana, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un dímero activador de la invención a un sujeto que lo necesite, donde el receptor diana es activado, y la enfermedad o afección resulta aliviada o inhibida.

Por consiguiente, en un aspecto adicional, la invención ofrece composiciones farmacéuticas que comprenden un dímero activador de la invención con un portador farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones farmacéuticas pueden comprender proteínas diméricas o ácidos nucleicos codificantes.

Otros objetos y ventajas serán evidentes a partir de una revisión de la descripción detallada subsiguiente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Definiciones

Según se utiliza en la presente memoria, el término "afección o enfermedad relacionada con un receptor diana" incluye generalmente una afección de un anfitrión mamífero, concretamente un anfitrión humano, que está asociado con un receptor diana concreto. De este modo, el tratamiento de una afección relacionada con un receptor diana incluirá el tratamiento de un mamífero, en particular, un ser humano, que tiene síntomas que reflejan una disminución de la activación del receptor diana, o que se espera que tenga una disminución de estos niveles en respuesta a una enfermedad, afección o régimen de tratamiento. El tratamiento de una afección o enfermedad relacionada con un receptor diana incluye el tratamiento de un sujeto humano donde la intensificación de la activación de un receptor diana con un dímero activador de la invención da como resultado un alivio de un síntoma no deseable resultante de la afección o enfermedad relacionada con el receptor diana. Según se utiliza en la presente memoria, una "afección relacionada con un receptor diana" también incluye una afección en la cual es deseable alterar, transitoriamente o a largo plazo, la activación de un receptor diana concreto.

Receptores Diana

Los receptores diana de la presente memoria son los receptores Tie (p. ej. Tie-1 o Tie-2). Los ligandos adecuados o sus fragmentos incluyen el dominio fibrinógeno de una angiopoyetina (p. ej. angiopoyetina-1 (ang-1), ang-2, ang-3, y/o ang-4). Estos son activados cuando son multimerizados.

Anticuerpos Específicos de Receptores Diana y Ligandos

Los dímeros activadores de la invención comprenden uno o más dominios de unión a inmunoglobulina aislados de anticuerpos generados contra un receptor diana seleccionado. El término "inmunoglobulina" o "anticuerpo" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a un polipéptido de... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido de fusión que comprende (A)x-M-(A')y, donde A es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo para un receptor Tie diana, A' es un dominio fibrinógeno de un ligando del receptor Tie o uno de sus fragmentos y es capaz de unirse al mismo receptor diana, M es un componente multimerizante, y X e Y son independientemente un número entre 1 y 10; y donde el polipéptido de fusión activa el receptor Tie diana induciendo la fosforilación de dicho receptor en su unión a él.

2. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, donde A' es un dominio fibrinógeno de Ang-1 o Ang-2 o uno de sus fragmentos.

3. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, donde el receptor Tie es humano, A es un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo, y A' es el dominio fibrinógeno de Ang-1 o Ang-2 humana o uno de sus fragmentos.

4. El polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde A es un fragmento Fv de cadena sencilla (ScFv).

5. El polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde A comprende una región variable de la cadena VH (residuos 33 a 154) y una región variable de la cadena VL (residuos 170 a 276) del SEQ ID NO: 30 o A comprende una región ScFv (residuos 33 a 276) del SEQ ID NO: 30.

6. El polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde X e Y son cada uno 1.

7. El polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el componente multimerizante es el dominio Fc de IgG.

8. El polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el receptor diana es un receptor Tie-1 o Tie-2.

9. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

10. Un dímero formado por dos de los polipéptidos de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. Un método de producción de un polipéptido de fusión, que comprende cultivar una célula anfitriona transfectada con un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9, en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína procedente de la célula anfitriona, y recuperar la proteína de fusión producida de ese modo.

12. Una composición farmacéutica que comprende el dímero de la reivindicación 10 y un portador farmacéuticamente aceptable.

13. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9.

14. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 9 conectado operablemente a una secuencia de control de la expresión.

15. Un sistema anfitrión-vector para la producción de polipéptidos de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende un vector de expresión de la reivindicación 14 introducido en una célula anfitriona aislada o un organismo no humano.

16. Un sistema anfitrión-vector de la reivindicación 15 que es un mamífero transgénico no humano.