ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-MET, SUS FRAGMENTOS Y VECTORES PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES Y PRODUCTOS CORRESPONDIENTES.

Anticuerpos monoclonales Anti-Met, sus fragmentos y vectores para el tratamiento de tumores y productos correspondientes Campo de la invención La presente invención se refiere al uso de un anticuerpo monoclonal, fragmentos y/o partes del mismo, y el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo monoclonal, fragmentos y/o partes del mismo para la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumores y metástasis y dispositivos de diagnóstico para detectar células neoplásicas, o bien in vivo, o in vitro. En particular, la presente invención se refiere al uso de un anticuerpo monoclonal anti-cMet dirigido contra el dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento de hepatocitos. Antecedentes de la invención La exploración científica de la inmunoterapia del cáncer comenzó en los años 1950 y la primera aplicación dependía de anticuerpos policlonales. Hoy, después de más de cinco décadas, inmunoterapia con anticuerpos monoclonales continúa ofreciendo una prometedora alternativa para el tratamiento de cáncer (1,2). Varios anticuerpos que dirigen receptores de tirosina quinasa (RTK) en cáncer se usan actualmente en la práctica clínica (3). El mecanismo de acción de estos anticuerpos es diferente en diferentes casos, y - a pesar de los ejemplos de aplicación exitosa - a menudo, se entiende escasamente (4). Bevacizumab y Cetuximab dirigen VEGF-VEGFR y EGF-EGFR, respectivamente, y actúan evitando la interacción ligando-receptor, (5,6). Herceptin es un anticuerpo monoclonal específico para HER2, un miembro de la familia EGFR. El mecanismo de acción que es el fundamento de la eficacia de Herceptin no está completamente claro pero se ha mostrado que promueve la degradación de HER2, disminuyendo de este modo los niveles de receptor en la superficie de las células tumorales (7). En oncogen MET, que codifica el receptor de tirosina quinasa para el Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF), controla los programas genéticos que conducen al crecimiento celular, invasión y protección de apoptosis. La activación no regulada de HGFR es crítica no solamente para la adquisición de de propiedades tumorigénicas sino también para el logro del fenotipo invasivo (8). El papel de MET en tumores humanos surgía de varios planteamientos experimentales y se probó inequívocamente por el descubrimiento de mutaciones de activación de MET en formas heredadas de carcinomas. (9,10). Además, la activación constitutiva de HGFR es frecuente también en cánceres esporádicos y los estudios de este y otros laboratorios han mostrado que el oncogen MET se sobreexpresa en tumores específicos de histotipos o se activa mediante mecanismos autocrinos. Además, el gen MET se amplifica en metástasis hematogénea de carcinomas colorrectales (11). La interferencia con la activación de Met llega a ser de este modo un planteamiento desafiante para impedir los procesos tumorigénicos y metastáticos. En los años pasados, se han propuesto varias estrategias para bloquear la señalización aberrante de HGFR, dirigiendo o bien el propio HGFR o su ligando. Estos planteamientos incluyen el uso de Antagonistas de HGF, anticuerpos neutralizantes de HGF, señuelos de HGFR, inhibidores de HGFR del sitio de unión de ATP de molécula pequeña o pequeñas moléculas tales como geldanamicina, polipéptidos y ribozimas de dominio SH2 (revisado en 12). Por ejemplo el documento WO 2005/016382 describe algunos de tales anticuerpos anti-HGFR de bloqueo. El documento WO 2005/016382 adicionalmente describe anticuerpos anti-HGFR (c-Met) agonísticos y propone el uso de estos anticuerpos agonísticos para la promoción de cicatrización de heridas pero no para la inhibición del crecimiento de células tumorales. Cortesina et al. (INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, 2005, vol. 89, no. 3, páginas 286 - 292) describen un anticuerpo DN-30 que se dirige contra el dominio extracelular del receptor MET. Dicho anticuerpo DN-30 se usa bajo el nombre AntiMET-R en la memoria descriptiva subyacente. Sin embargo, la terapéutica de la eficacia de dicho anticuerpo o el hecho de que el desprendimiento del dominio extracelular del receptor de MET se induce por este anticuerpo no se conocía previamente. Sumario de la invención La presente invención se refiere al uso de un anticuerpo monoclonal dirigido contra el dominio extracelular del Receptor del Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGFR) en el tratamiento de tumores y/o metástasis en un sujeto afectado por un tumor y en dispositivos de diagnóstico para detectar células neoplásicas, o bien in vivo, o in vitro. De este modo el objeto de la presente invención es, el uso de of i) un anticuerpo monoclonal anti-cMet, ii) un fragmento que contiene la región de unión a epítope de un anticuerpo monoclonal anti-cMet y/o iii) un anticuerpo modificado por ingeniería genética que contiene la región de unión a epítope o las regiones determinantes complementarias (CDR) de un anticuerpo monoclonal anti-cMet para la preparación de un medicamento para el 2   tratamiento de tumores y metástasis en un sujeto que sufre un tumor y para dispositivos de diagnóstico para detectar células neoplásicas, o bien in vivo, o in vitro, en el que el anticuerpo monoclonal anti-cMet - llamado AntiMET-R lo produce la línea celular de hibridoma depositada por el Centro de Biotecnología Avanzada (ABC), Colección de Líneas Celulares Interlab (ICLC), S.S. Banca Cellule e Colture en GMP, Largo Rosanna Benzi 10, Génova, Italia con número de acceso ICLC PD 05006. Otro objeto de la presente invención es el uso de un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la región de unión a epítope o las CDR del anticuerpo monoclonal anti-cMet producido por la línea celular de hibridoma ICLC PD 05006 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumores y metástasis en un sujeto afectado por un tumor. Otro objeto de la presente invención es el uso de i) el anticuerpo monoclonal anti-cMet, ii) un fragmento que contiene la región de unión a epítope del anticuerpo monoclonal anti-cMet y/o iii) un anticuerpo modificado por ingeniería genética que contiene la región de unión a epítope o las CDR del anticuerpo monoclonal anti-cMet y al menos un inhibidor de quinasa como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia de tumor y/o metástasis. De acuerdo con la presente invención, estos propósitos se logran por medio de las reivindicaciones que siguen, que son parte integral de la enseñanza técnica proporcionada en el presente documento con respecto a la invención. Breve descripción de los dibujos - Figura 1. AntiMET-R altera la activación de HGFR y transducción de señal (A) Evaluación de la activación de HGFR. Células GTL16 se expusieron a AntiMET-R para los tiempos indicados. HGFR se inmunoprecipitó de los lisados celulares y se sondaron transferencias de Western con los Abs indicados. El tratamiento con AntiMET-R dio como resultado una disminución de la activación del receptor más pronunciada que la regulación descendente del receptor, como se ha indicado por cuantificación de densidad de bandas. (B) Análisis de señalización de HGFR. Las células se trataron previamente con o bien VSV-G o AntiMET-R y después se estimularon con HGF durante los tiempos indicados. La fosforilación de Akt se evaluó en el lisado total de células. Como se muestra en el panel superior, AntiMET-R redujo la activación de Akt tanto basal como la inducida por HGF. - Figura 2. AntiMET-R inhibe el fenotipo transformado de células cancerosas in vitro. (A) Crecimiento independiente del anclaje de células GTL16. Se sembraron células tratados previamente en agar al 0,5 %. Después las células se mantuvieron en la presencia de las cantidades indicadas de Abs AntiMET-R o VSV-G y después de 10 días, se tiñeron las colonias desarrolladas. El crecimiento independiente del anclaje se inhibió notablemente incluso a bajas dosis de AntiMET-R. (B) Ensayo de invasión. MDA-MB-435 ß4 se trataron previamente con los anticuerpos indicados durante 24 horas antes de sembrar sobre una cámara Transwell recubierta con matrigel. La cámara inferior se cargo con DMEM 2 % FBS +100 ng/ml HGF. Después de 24 horas, se tiñeron las células migradas y se contaron. La capacidad invasiva en respuesta a HGF se expresa como veces de incremento en comparación con células no estimuladas. Como se muestra, el tratamiento con AntiMET-R redujo significativamente la invasión celular. - Figura 3. AntiMET-R inhibe el fenotipo transformado de células cancerosas in vivo (A, B) Ensayo de tumorigénesis. A ratones desnudos se les inyectaron por vía subcutánea 1,5 x 10 6 células GTL16. Después de la la aparición de tumor, se seleccionaron ratones que muestran tumores del mismo tamaño y después les se inyectaron in situ dos veces a la semana 2 g/gr de o bien... [Seguir leyendo]

ii) un fragmento de (i) que contiene las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-cMet AntiMET-R , en el que CDR-H1 es la SEQ ID NO.:8, CDR-H2 es la SEQ ID NO.:9, CDR-H3 es la SEQ ID NO.: 10, CDR-L1 es la SEQ ID NO.:11, CDR-L2 es la SEQ ID NO.:12 y CDR-L3 es la SEQ ID NO.:13, y/o iii) un anticuerpo modificado por ingeniería genética que contiene las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-cMet AntiMET-R, en el que CDR-H1 es la SEQ ID NO.:8, CDR-H2 es la SEQ ID NO.:9, CDR-H3 es la SEQ ID NO.:10, CDR-L1 es la SEQ ID NO.:11, CDR-L2 es la SEQ ID NO.:12 and CDR-L3 es la SEQ ID NO.:13 para la producción de un medicamento para el tratamiento de tumor y/o metástasis en un paciente que padece un tumor, en el que dicho anticuerpo AntiMET-R lo produce la línea celular de hibridoma ICLC PD 05006. 2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo, dicho fragmento y/o dicho anticuerpo modificado por ingeniería genética están en la forma de proteína soluble. 3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo y/o dicho anticuerpo modificado por ingeniería genética están producidos por un procedimiento seleccionado entre el grupo que consta de técnica de ADN recombinante, síntesis en fase sólida, síntesis en fase líquida. 4. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho fragmento se selecciona entre el grupo que consta de Fab, F(ab)2, Fab, Fv, scFv, y un péptido que contiene las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-cMet AntiMET-R, en el que CDR-H1 es la SEQ ID NO.:8, CDR-H2 es la SEQ ID NO.:9, CDR-H3 es la SEQ ID NO.: 10, CDR-L1 es la SEQ ID NO.:11, CDR-L2 es la SEQ ID NO.:12 y CDR-L3 es la SEQ ID NO.:13. 5. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho fragmento está producido por un procedimiento seleccionado entre el grupo que consta de escisión proteolítica de dicho anticuerpo, técnica de ADN recombinante, síntesis en fase sólida, síntesis en fase líquida 6. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho medicamento es para la administración por inyección o por infusión. 7. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho tumor se selecciona entre tumor colorrectal y tumor de hígado. 8. Uso de a secuencia de nucleótidos que codifica i) el anticuerpo monoclonal anti-cMet AntiMET-R, ii) un fragmento de (i) que contiene las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-cMet AntiMET-R, en el que CDR-H1 es la SEQ ID NO.:8, CDR-H2 es la SEQ ID NO.:9, CDR-H3 es la SEQ ID NO.: 10, CDR-L1 es la SEQ ID NO.:11, CDR-L2 es la SEQ ID NO.:12 y CDR-L3 es la SEQ ID NO.:13 y/o iii) un anticuerpo modificado por ingeniería genética que contiene las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-cMet AntiMET-R, en el que CDR-H1 es la SEQ ID NO.:8, CDR-H2 es la SEQ ID NO.:9, CDR-H3 es la SEQ ID NO.:10, CDR-L1 es la SEQ ID NO.:11, CDR-L2 es la SEQ ID NO.:12 and CDR-L3 es la SEQ ID NO.:13 para la producción de un medicamento para el tratamiento de tumor y/o metástasis en un paciente que padece un tumor, en el que dicho anticuerpo monoclonal anti-cMet AntiMET-R lo produce la línea celular de hibridoma ICLC PD 05006. 9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos comprende al menos: i) SEQ ID NO.:1 y la SEQ ID NO.:2, ii) una secuencia de nucleótidos que corresponde a la SEQ ID NO.:1 y la SEQ ID NO.:2, en el que están presentes una o más sustituciones silenciosas. 10. Uso de un vector que comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica 29   i) el anticuerpo monoclonal anti-cMet AntiMET-R, ii) un fragmento de (i) que contiene las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-cMet AntiMET-R, en el que CDR-H1 es la SEQ ID NO.:8, CDR-H2 es la SEQ ID NO.:9, CDR-H3 es la SEQ ID NO.: 10, CDR-L1 es la SEQ ID NO.:11, CDR-L2 es la SEQ ID NO.:12 y CDR-L3 es la SEQ ID NO.:13 y/o iii) un anticuerpo modificado por ingeniería genética que contiene las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-cMet AntiMET-R, en el que CDR-H1 es la SEQ ID NO.:8, CDR-H2 es la SEQ ID NO.:9, CDR-H3 es la SEQ ID NO.:10, CDR-L1 es la SEQ ID NO.:11, CDR-L2 es la SEQ ID NO.:12 and CDR-L3 es la SEQ ID NO.:13, en el que el anticuerpo monoclonal anti-cMet AntiMET-R lo produce la línea celular de hibridoma ICLC PD 05006, para la preparación de un medicamento para el tratamiento of tumor y/o metástasis en un sujeto que padece un tumor. 11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque dicho vector comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre: i) SEQ ID NO.:1 y la SEQ ID NO.:2, ii) una secuencia de nucleótidos que corresponde a la SEQ ID NO.:1 y la SEQ ID NO.:2, en la que están presentes una o más sustituciones silenciosas. 12. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque dicho vector está en la forma de una partícula. 13. Producto que contiene i) el anticuerpo monoclonal anti-cMet AntiMET-R, ii) un fragmento of (i) que contiene las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-cMet AntiMET-R, en el que CDR-H1 es la SEQ ID NO.:8, CDR-H2 es la SEQ ID NO.:9, CDR-H3 es la SEQ ID NO. 10, CDR-L1 es la SEQ ID NO.:11, CDR-L2 es la SEQ ID NO.:12 and CDR-L3 es la SEQ ID NO.:13 y/o iii) un anticuerpo modificado por ingeniería genética que contiene las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-cMet AntiMET-R, en el que CDR-H1 es la SEQ ID NO.:8, CDR-H2 es la SEQ ID NO.:9, CDR-H3 es la SEQ ID NO.:10, CDR-L1 es la SEQ ID NO.:11, CDR-L2 es la SEQ ID NO.:12 y CDR-L3 es la SEQ ID NO.:13 y al menos un inhibidor de quinasa como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento of tumores y/o metástasis, en el que dicho anticuerpo monoclonal anti-cMet AntiMET-R lo produce la línea celular de hibridoma ICLC PD 05006. 14. Producto de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho anticuerpo y/o dicho al menos un fragmento del mismo están en la forma de soluble proteína. 15. Producto de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho anticuerpo y/o dicho anticuerpo modificado por ingeniería genética se producen por un procedimiento seleccionado entre el grupo que consta de: técnica de ADN recombinante, síntesis en fase sólida, síntesis en fase líquida. 16. Producto de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho fragmento se selecciona entre el grupo que consta de Fab, F(ab)2, Fab, Fv, scFv, péptido que contiene las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal anti-cMet AntiMET-R, en el que CDR-H1 es la SEQ ID NO.:8, CDR-H2 es la SEQ ID NO.:9, CDR-H3 es la SEQ ID NO.:10, CDR-L1 es la SEQ ID NO.:11, CDR-L2 es la SEQ ID NO.:12 y CDR-L3 es la SEQ ID NO.:13. 17. Producto de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho fragmento se produce por un procedimiento seleccionado entre el grupo que consta de escisión proteolítica de dicho anticuerpo, técnica de ADN recombinante, síntesis en fase sólida o síntesis en fase líquida. 18. Producto de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho al menos un inhibidor de quinasa se selecciona entre el grupo que consta de análogo de estaurosporina K252A; (3Z)-5-[(2,6-diclorobencil)sulfonil]-3- [(3,5-dimetil-4-{[(2R)-2-(pirrolidin-1-ilmetil)pirrolidin-1-il]carbonil}-1H-pirrol-2-il)metilen]-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona; [(3Z)-N-(3-clorofenil)-3-({3,5-dimetil-4-[(4-metilpiperazin-1-il)carbonil]-1H-pirrol-2-il}metilen)-N-metil-2-oxoindolina- 5sulfonamida]; [(3Z)-5-(2,3-dihidro-1H-indol-1-ilsulfonil)-3-({3,5-dimetil-4-[(4-metilpiperazin-1-il)carbonil]-1H-pirrol- 2il}metilen)-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona]; [(3Z)-N-(3-clorofenil)-3-{[3,5-dimetil-4-(3-morpholin-4-ilpropil)-1H-pirrol-2-   il]metilen}-N-metil-2-oxoindolina-5-sulfonamida]. 19. Producto de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho producto es para la administración por inyección o por infusión. 31   32   33   34     36   37   38   39     41   42   43   cadena ligera 44     46   47   48