PROCEDIMIENTO PARA CLONACIÓN DE ANTICUERPOS ANÁLOGOS.

La presente invención se refiere a un procedimiento para enlazar pares análogos de secuencias que codifican para VH y VL a partir de una población de células enriquecidas en marcadores de antígenos de superficie particulares. El procedimiento de enlace implica un procedimiento de amplificación molecular múltiplex capaz de enlazar secuencias nucleótidas de interés en relación con la amplificación, en particular reacción en cadena de polimerasa (PCR múltiplex). El procedimiento es particularmente ventajoso para la generación de bibliotecas de pares análogos así como bibliotecas combinatorias de secuencias codificantes de región variable para imunoglobulina. La invención también se refiere a procedimientos para generación de anticuerpos quiméricos humanos/no humanos y bibliotecas de expresión generadas por tales procedimientos. Antecedentes de la invención El documento WO 2005/042774 (Symphogen) desvela un procedimiento para enlazar secuencias nucleótidas de interés, en particular pares análogos de secuencias que codifican para VH y HL utilizando un procedimiento molecular múltiplex. Las secuencias de interés preferiblemente se amplifican y enlazan a partir de células solas aisladas después de dilución limitada u otras técnicas de separación de células. La referencia desvela varias maneras de enriquecer una población de células que contienen linfocitos para obtener una población de células plasmáticas que son particularmente adecuadas para el procedimiento de amplificación molecular múltiplex. El documento WO 2007/003041 desvela un procedimiento para aislar una célula de secreción de anticuerpos que tiene una alta probabilidad de secretar un anticuerpo específico para un antígeno deseado, que comprende las etapas: a) proporcionar una muestra de un animal que se ha inmunizado recientemente con el antígeno deseado, en el que la muestra comprende una población de células que secretan anticuerpos que secretan anticuerpos específicos para el antígeno deseado; b) aumentar la concentración de células que secretan anticuerpos en la muestra; y c) aislar una célula que secreta anticuerpos. La concentración de células que secretan anticuerpos en la muestra se puede aumentar por medio del enriquecimiento de las células o por medio de la depleción de las células en la muestra con marcadores de superficie. Sumario de la invención La presente invención está enfocada en procedimientos para generar bibliotecas de secuencias que codifican para inmunoglobulina a partir de animales no humanos y procedimientos para generar, en algunas etapas adaptadas para clonación y cribado de alto rendimiento, bibliotecas de vectores que codifican para anticuerpos quiméricos que comprenden regiones constantes humanas y regiones variables no humanas. En un primer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para producir una biblioteca de pares análogos que comprenden secuencias que codifican para la región variable enlazada, comprendiendo dicho procedimiento: a) proporcionar una fracción de células que comprenden linfocitos de un donante roedor; b) obtener una población de células solas aisladas, distribuyendo células de dicha fracción celular individualmente en una pluralidad de recipientes, en los que por lo menos una subpoblación de las células expresadas están enriquecidas y expresan antígenos CD43 y CD138 o antígenos MHCII y B220; y c) amplificar y llevar a cabo el enlace de las secuencias codificantes de la región variable contenidas en dicha población de células solas aisladas por amplificación, en un procedimiento de amplificación molecular múltiplex, de secuencias nucleótidas de interés utilizando una plantilla derivada de una sola célula aislada o una población de células isogénicas y llevar a cabo el enlace de las secuencias nucleótidas de interés amplificadas. Este procedimiento proporciona una biblioteca de anticuerpos de pares análogos o fragmentos de anticuerpos. En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para enlazar de forma aleatoria una pluralidad de secuencias nucleótidas no contiguas de interés, en el que dichas secuencias nucleótidas de interés comprenden secuencias codificantes para la región variable y el enlace genera una biblioteca combinatoria de pares de secuencias codificantes para la región variable, comprendiendo dicho procedimiento: a) Amplificar, en un procedimiento de amplificación molecular múltiplex, secuencias nucleótidas de interés usando una plantilla derivada de una población de células genéticamente diversas, en el que las células genéticamente diversas se derivan de una fracción celular que comprende linfocitos de un donante roedor, y en el que al menos una subpoblación de las células está enriquecida y expresa los antígenos CD43 y CD138 o los antígenos MHCII y B220; y b) Llevar a cabo el enlace de las secuencias nucleótidas de interés amplificadas en la etapa a). Este procedimiento proporciona preferiblemente una biblioteca combinatoria de dominios variables de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera combinados aleatoriamente. Las pruebas experimentales que se proporcionan en la presente solicitud establecen que las poblaciones de células aisladas de esplenocitos de ratón y que son positivas para los antígenos de superficie enumerados proporcionan buen material de partida para clonación de secuencias que codifican anticuerpos utilizando un procedimiento de amplificación molecular múltiplex. Los procedimientos de la invención se pueden aplicar fácilmente a otras especies 2 E08706942 17-10-2011   que expresan los ortólogos de CD43 y CD138 o MHCII y B220, en particular, se pueden aplicar los procedimientos a otros roedores, tal como ratas. El procedimiento proporciona varias ventajas sobre la generación alternativa, por ejemplo de hibridoma. Cuando se prepara un hibridoma de un ratón inmunizado, las líneas de células establecidas codifican un repertorio de isotipos de anticuerpos diferentes. Las líneas de células de hibridoma posteriormente necesitan ser cribadas para función (por ejemplo, unión a un antígeno específico, eficacia en neutralización del patógeno) y para el isotipo de anticuerpo. Por lo tanto se requiere un procedimiento de cribado de dos etapas para seleccionar un hibridoma con un isotipo de anticuerpo particular y con un efecto particular en un análisis funcional. Finalmente, con el fin de generar una línea de células productoras, el anticuerpo secretado por el hibridoma seleccionado necesita ser clonado y secuenciado antes de que se pueda transferir a una línea de células productoras. Mediante el uso del procedimiento de la presente invención, se determinan isotipos de anticuerpo por los cebadores usados para la amplificación molecular múltiplex y por lo tanto no hay necesidad de que se determinen. El isotipo de anticuerpo también se puede determinar (y se puede cambiar) por el enlace o empalmes subsiguientes de dominios constantes a secuencias variables clonadas. Además, el procedimiento de la invención proporciona una biblioteca de polinucleótidos que se pueden secuenciar y/o insertar fácilmente en vectores, tales como los vectores de expresión, de transferencia, de presentación o lanzadera, de manera que una vez que se ha seleccionado un anticuerpo particular, se clone de antemano, y su secuencia se conozca de antemano y pueda ser transferido con facilidad a un vector de expresión apropiado para producción de anticuerpo. Se espera que las células clasificadas de acuerdo con el protocolo proporcionado suministren una fuente de anticuerpos de alta afinidad, potencialmente con afinidades en el intervalo picomolar. Los anticuerpos monoclonales de hibridoma no poseen afinidades en el intervalo picomolar y necesitarán ser madurados por afinidad sintéticamente para alcanzar estas afinidades. De acuerdo con una realización, estos procedimientos comprenden además determinar antes de la amplificación molecular múltiplex que la población de células que comprenden linfocitos comprende células que expresen los antígenos CD43 y CD138 o los antígenos MHCII y B220, preferiblemente CD43 y CD138. También los procedimientos pueden incluir enriquecer la fracción de células que comprenden linfocitos para una población de linfocitos que expresan los antígenos CD43 y CD138 o MHCII y B220 antes de la amplificación molecular múltiplex. Preferiblemente, los procedimientos comprenden además aislar de la población que comprende linfocitos células que expresan los antígenos CD43 y CD138 o los antígenos MHCII y B220 antes de la amplificación molecular múltiplex. En una realización preferida, las células aisladas o las subpoblación de células son altas en CD138/altas en CD43 o intermedias en CD138/altas en CD43 en relación a la fracción de células que comprenden linfocitos. De manera más preferible, las células aisladas o... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir una biblioteca de pares análogos que comprenden secuencias que codifican para la región variable enlazada, comprendiendo dicho procedimiento: a) proporcionar una fracción de células que comprende linfocitos de un donante; b) obtener una población de células solas aisladas distribuyendo células de la fracción celular individualmente en una pluralidad de recipientes, en donde por lo menos una subpoblación de células están enriquecidas y expresan antígenos CD43 y CD138 o antígenos MHCII y B220; y c) amplificar y llevar a cabo el enlace de las secuencias codificantes de región variable contenidas en dicha población de células solas aisladas por amplificación, en un procedimiento de amplificación molecular múltiplex, secuencias nucleótidas de interés utilizando una plantilla derivada de una sola célula aislada o una población de células isogénicas; y llevar a cabo el enlace de las secuencias nucleótidas de interés amplificadas. 2. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, en el que la fracción de células que contienen linfocitos comprende esplenocitos, sangre entera, médula ósea, células mononucleares o leucocitos, preferiblemente esplenocitos o médula ósea, más preferiblemente esplenocitos; y opcionalmente en el que la fracción de células que contienen linfocitos o línea de linfocitos B se enriquece en plasmocitos o plasmablastos. 3. El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que las secuencias nucleótidas de interés comprenden secuencias que codifican para una región variable de inmunoglobulina y el enlace genera un par análogo de una secuencia que codifica para una región variable de cadena ligera asociada con una secuencia que codifica para una región variable de cadena pesada. 4. Un procedimiento de enlace aleatoriamente de una pluralidad de secuencias nucleótidas no contiguas de interés, en el que dichas secuencias nucleótidas de interés comprenden secuencias que codifican para una región variable y el enlace genera una biblioteca combinatoria de pares de secuencias que codifican para una región variable, preferiblemente en el que dichas secuencias nucleótidas de interés comprenden secuencias que codifican para la región variable de inmunoglobulina y el enlace genera una biblioteca combinatoria de pares de secuencias que codifican para una región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada, comprendiendo dicho procedimiento: a) amplificar, en un procedimiento de amplificación molecular múltiplex, secuencias nucleótidas de interés utilizando una plantilla derivada de una población de células genéticamente diversas; en el que las células genéticamente diversas se derivan de una fracción de células que comprenden linfocitos de un donante roedor; y en el que al menos una subpoblación de las células están enriquecidas en y expresan los antígenos CD43 y CD138 o los antígenos MHCII y B220; y b) llevar a cabo el enlace de las secuencias nucleótidas de interés amplificadas en la etapa a). 5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además determinar, antes de la amplificación molecular múltiplex que la población de células que comprenden linfocitos comprende células que expresan los antígenos CD43 y CD138 o los antígenos MHCII y B220, preferiblemente CD43 y CD138. 6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además enriquecer dicha fracción de células que comprenden linfocitos para una población de linfocitos que expresan los antígenos CD43 y CD138 o MHCII y B220 antes de amplificación molecular múltiplex. 7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además aislar de dicha población que comprende linfocitos células que expresan los antígenos CD43 y CD138 o los antígenos MHCII y B220 antes de amplificación molecular múltiplex. 8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el enriquecimiento o aislamiento comprende un procedimiento de clasificación automatizado MACS, FACS u otro. 9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el donante es un ratón. 10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el ratón es un ratón transgénico. 11. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho procedimiento de amplificación molecular múltiplex es una amplificación RT-PCR múltiplex, y en el que: dicha amplificación RT-PCR múltiplex es un procedimiento de dos etapas que comprende una etapa de transcripción inversa separada antes de la amplificación PCR múltiplex, o en el que dicha amplificación RT-PCR múltiplex se realiza en una etapa única que comprende inicialmente agregar la totalidad de los componentes necesarios para realizar tanto transcripción inversa como amplificación por PCR múltiplex en un solo recipiente. 12. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho enlace de las secuencias nucleótidas de interés se lleva a cabo en asociación con la amplificación PCR múltiplex, utilizando una mezcla de cebador de superposición-extensión múltiplex. 34 E08706942 17-10-2011   13. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, en el que la mezcla de cebador de superposiciónextensión múltiplex comprende: a) por lo menos un cebador mKappar1 o hmJK complementario a la cadena directa de una secuencia que codifica para la región de cadena ligera de inmunoglobulina; b) por lo menos un cebador mVK complementario a la cadena antisentido de una secuencia que codifica para la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina o la secuencia líder de la región variable de cadena ligera y capaz de formar un conjunto de cebador con uno o varios de los cebadores en la etapa a); c) por lo menos un cebador mCHrev1, mCHrev1-ext o mJH complementario a la cadena directa de una secuencia que codifica para el dominio de cadena pesada de inmunoglobulina; y d) por lo menos un cebador mVH complementario a la cadena antisentido de una secuencia que codifica para la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina o la secuencia líder de región variable de cadena pesada, y capaz de formar un conjunto de cebador con uno o varios de los cebadores en la etapa c). 14. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además insertar las secuencias nucleótidas enlazadas o una biblioteca de pares análogos en un vector; y que además comprende opcionalmente las etapas de: a) introducir un vector que codifica para un segmento de secuencias nucleótidas enlazadas en una célula hospedadora; b) cultivar dichas células hospedadoras bajo condiciones adaptadas por expresión; y c) obtener el producto de proteína expresado del vector insertado en dicha célula hospedadora. 15. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 14, en el que las secuencias nucleótidas enlazadas o los elementos individuales de la biblioteca de pares análogos comprenden una secuencia que codifica para una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina asociada con una secuencia que codifica para una región variable de la cadena ligera y dichas secuencias se insertan en marco en un vector que contiene las secuencias que codifican uno o más dominios constantes de inmunoglobulina o fragmentos de los mismos. 16. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 15, que además comprende transferir a dicho par análogo o biblioteca de pares análogos específicos de diana de secuencias que codifican para una región variable a un vector de expresión de mamífero, en el que el vector de expresión de mamífero opcionalmente codifica para uno o más dominios de región constante seleccionados de las clases de inmunoglobulina humana IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, cadena ligera kappa o cadena pesada lambda. E08706942 17-10-2011   Fig. 1 36 E08706942 17-10-2011   Fig. 2 37 E08706942 17-10-2011   Fig. 3A 38 E08706942 17-10-2011   Fig. 3B 39 E08706942 17-10-2011   Fig. 5 E08706942 17-10-2011   Fig. 6 41 E08706942 17-10-2011   Fig. 7 42 E08706942 17-10-2011