VARIANTES DE LA MOLECULA GP130 SOLUBLES UTILES COMO MEDICAMENTO.

Polipéptido-dímero de dos fragmentos monoméricos, en el que los fragmentos monoméricos comprenden (a) los dominios 1 a 3 (D1 a D3) de la parte extracelular de la glicoproteína (gp) 130 pero no contienen dominios adicionales (D4 a D6) de sgp130 y (b) en sus extremos C-terminal un espaciador polipéptido que posee una longitud de 5 a 30 aminoácidos,

en el que ambos fragmentos monoméricos están unidos covalentemente entre sí, en el que la longitud del espaciador determina la unión óptima de la proteína dimérica resultante al complejo IL-6/receptor de IL-6 soluble y en el que dicho polipéptido-dímero muestra un potencial significativamente reducido de formar agregados homoméricos y fragmentos de moléculas y en el que se obtiene una productividad significativamente incrementada en células huésped

Se describe un polipéptido-dímero formado por dos fragmentos monoméricos idénticos que comprende los dominios 1 a 3 de la parte extracelular (soluble) de la glicoproteína (gp) 130 y un espaciador polipéptido concreto, unidos covalentemente entre sí, y que supone ventajas significativas respecto a su tasa de producción en células huésped, su purificación mejorada y su potencial para unirse a complejos IL-6/receptor IL-6 soluble. Además, se describe

muestra un amplio espectro de funciones biológicas entre las cuales las más notables son la estimulación de las células B y T, el control de los procesos inmunitarios adquiridos e innatos y la inducción de la síntesis de proteínas de fase aguda en el hígado. La IL-6 ejerce su actividad a través de un receptor IL-6 unido a membrana o soluble (“IL-6R” o “gp80”) el cual tras la unión induce la dimerización de la gp130 para desencadenar respuestas celulares.

Dado que el domino citoplasmático de IL-6R carece de actividad quinasa, la señalización por el homodímero gp130 puede ser inducida por la IL-6 unida al IL-6R unido a membrana o soluble. Mientras que gp130 puede hallarse en prácticamente todos los tipos celulares, la expresión de

IL-6R está restringida a los hepatocitos y leucocitos. Sin embargo, las células pueden ser activadas por IL-6 a través de sIL-6R el cual es liberado desde las células que expresan IL-6R ya sea mediante escisión proteolítica o mediante corte y empalme (splicing) alternativo. Este mecanismo se denomina trans-señalización. De hecho, se ha demostrado que diversas

infiltrados neutrofílicos y el reclutamiento y activación de células T y B para una respuesta inmunitaria mantenida. La alteración de la regulación de este mecanismo conlleva el desarrollo y persistencia de enfermedades alérgicas inflamatorias y/o crónicas tales como la enfermedad de Crohn, la artritis reumatoide, el asma y otras.

Para el tratamiento de estas enfermedades, se ha demostrado que el bloqueo específico de los procesos mediados por IL-6 es terapéuticamente efectivo. Desafortunadamente, todos los compuestos disponibles en la actualidad para este fin hasta el momento tienen el problema de provocar efectos secundarios graves en parte (por ejemplo infecciones secundarias, tuberculosis, sepsis), toxicidad o inmunogenicidad. Adicionalmente, también se han observado dificultades indisolubles durante el desarrollo de un procedimiento de purificación útil y económico.

La solución de estos problemas técnicos se consigue

mediante las realizaciones caracterizadas en las

reivindicaciones. En el transcurso de los experimentos que han dado lugar a la presente invención, se observó que la purificación del compuesto original sgp130F que comprende dos moléculas de la parte extracelular completa de gp130 era insatisfactoria. Esta proteína de fusión, si se expresa en células eucariotas CHO tiende a formar productos secundarios indeseables tales como ciertos fragmentos más pequeños, oligómeros y agregados en combinaciones diversas. No fue posible hallar ningún tipo de método de purificación que fuera adecuado para separar el compuesto diana de estas impurezas en cantidades adecuadas debido a las propiedades físicas y químicas muy similares entre las impurezas y el

para cambiar la solubilidad de la proteína mediante suplementación iónica o cambios en el pH y otros. Ninguno de estos métodos dio resultados satisfactorios o fue adecuado para ser realizado a mayor escala para desarrollar un proceso de purificación que cumpliera con las buenas prácticas de fabricación (GMP). Por el contrario, se observó que una variante más corta de la molécula original sgp130Fc, denominada sgp130(D1-3)Fc, que carece de los dominios extracelulares 4 a 6 era separable de los productos secundarios contaminantes. Ello indicaba que los elementos formadores de agregados con los dominios de fibronectina III (dominios 4 a 6) de la molécula original sgp130Fc se habían eliminado con éxito. Además, esta molécula se expresó por

células eucariotas a niveles considerablemente más elevados.

En la siguiente etapa se optimizó la eficiencia de unión a IL-6/sIL-6R de la nueva molécula sgp130(D1-3)Fc mediante la fusión de espaciadores polipéptidos de diferente longitud entre sgp130(D1-3) y la parte IgG-Fc. La capacidad de unión de las moléculas resultantes se determinó mediante ensayos de enzimoinmunoanálisis (ELISA) específicos y se comparó con la molécula original sgp130Fc (Figura 5).

Se ha demostrado que la unión de los complejos IL-6/sIL-6R inhibe el efecto anti-apoptótico de IL-6 sobre los monolitos en pacientes con enfermedad de Crohn indicando que dicho compuesto es útil para el tratamiento de dicha enfermedad y de enfermedades relacionadas tales como la colitis, la artritis reumatoide, la psoriasis, la peritonitis y otras.

La enfermedad de Crohn es una enfermedad inflamatoria crónica de todo el tracto gastrointestinal caracterizada por recidivas frecuentes de inflamación aguda. La inflamación asociada con infección, lesión y otros factores induce rápidamente una reacción de fase aguda (APR) acompañada de la expresión de proteínas de fase aguda (APPs). La APR provoca principalmente un aumento de la permeabilidad vascular y fiebre. Los miembros de la familia de la IL-6 incrementan la expresión de los genes APP de tipo II que está mediada por la (STAT3). La potente activación de STAT3 (es decir fosforilación de tirosina) se ha descrito en tejido de colon de pacientes con enfermedades intestinales inflamatorias (IBD). Además, se ha observado una disminución

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de la actividad STAT3 en ratones IL-6 asociada a una

disminución del desarrollo de colitis de ratón experimental

(Suzuki y otros, J. Exp. Med 2001, 193:471). Esto experimentos indican que la activación de STAT3 mediada por IL-6/sIL-6R juega un papel clave en el desarrollo y perpetuación de la colitis. En otro modelo inflamatorio, la artritis reumatoide (RA), se ha demostrado que STAT3 es importante para la supervivencia de los fibroblastos sinoviales de la RA (Krause y otros, J. Immunol, 2002, 169:6610). Por ello se ha sugerido que STAT3 puede ser una buena diana para la terapia génica. También se conoce que la activación constitucional de STAT3 es un factor “causante de cáncer” y se acompaña de un incremento de proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2 y Bcl-XL (Turkson y otros, Oncogene, 2000, 19:6613).

Se ha observado que la activación de STAT3 mediada por IL-6/sIL-6R es reducida significativamente por sgp130(D1-3)Fc con un nivel de eficacia comparable al del compuesto original sgp130Fc. Además, sgp130(D1-3)Fc (sgp130Var) se expresa en células eucariotas en cantidades más elevadas que sgp130Fc, genera menos productos secundarios no deseados y es separable de las impurezas residuales mediante cromatografía en columna estándar. Estas ventajas mejoran de forma significativa el desarrollo de procedimientos de producción acordes con las GMP y disminuye el coste de los productos.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Dibujo esquemático de las moléculas

sgp130(D1-D3)Sn

Las variantes sgp130(D1-D3)Sn se generaron mediante deleción de los dominios D4 a D6 de la molécula original

sgp130Fc y su substitución por un espaciador polipéptido de longitud diversa (Sn). La “n” indica el número de repeticiones dentro de la región del espaciador. A continuación la molécula se dimeriza covalentemente ya sea mediante un fragmento IgG-Fc (panel superior) para construir sgp130(D1-D3)Sn-Fc o (panel inferior) mediante fusión adicional con un elemento conector artificial o natural que confiere uniones covalentes, por ejemplo mediante la formación de puentes disulfuro, interacciones químicas u otros (sgp130(D1-D3)Sn-L). Además, estas moléculas pueden contener etiquetas para la purificación...

1. Polipéptido-dímero de dos fragmentos monoméricos, en el que los fragmentos monoméricos comprenden (a) los dominios 1 a 3 (D1 a D3) de la parte extracelular de la glicoproteína (gp) 130 pero no contienen dominios adicionales (D4 a D6) de sgp130 y (b) en sus extremos C-terminal un espaciador polipéptido que posee una longitud de 5 a 30 aminoácidos, en el que ambos fragmentos monoméricos están unidos covalentemente entre sí, en el que la longitud del espaciador determina la unión óptima de la proteína dimérica resultante al complejo IL-6/receptor de IL-6 soluble y en el que dicho polipéptido-dímero muestra un potencial significativamente reducido de formar agregados homoméricos y fragmentos de moléculas y en el que se obtiene una productividad significativamente incrementada en células huésped.

2. Polipéptido-dímero, según la reivindicación 1, en el que los dos fragmentos monoméricos son idénticos.

3. Polipéptido-dímero, según la reivindicación 1 o 2, en el que la dimerización covalente de ambos monómeros se obtiene mediante uno o más puentes disulfuro.

4. Polipéptido-dímero, según la reivindicación 3, en el que el o los puentes disulfuro se generan mediante la fusión de los fragmentos monoméricos a una molécula IgG-Fc.

5. Polipéptido-dímero, según la reivindicación 3, en el que el o los puentes disulfuro se generan mediante la

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6. Polipéptido-dímero, según la reivindicación 1 o 2, en el que la dimerización covalente de ambos monómeros se obtiene mediante cualquier otro tipo de unión química o física.

7. Polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el espaciador polipéptido está glicosilado selectivamente para proteger la molécula de la escisión proteolítica.

8. Polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el espaciador polipéptido posee una longitud de 10 a 25 aminoácidos.

9. Polipéptido-dímero, según la reivindicación 8, en el que el espaciador polipéptido posee una longitud de 15 a 25 aminoácidos.

10. Polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el espaciador posee la secuencia de aminoácidos (GGGGS)n siendo n 1, 2, 3, 4, 5 o fusión de los fragmentos monoméricos a un polipéptido natural o artificial, que comprende uno o más residuos cisteína libremente accesibles.

6.

11. Polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que forma menos de un 50% de agregados homoméricos y fragmentos de moléculas.

12. Polipéptido-dímero, según la reivindicación 11, que forma menos de un 25% de agregados homoméricos y fragmentos de moléculas.

13. Polipéptido-dímero, según la reivindicación 12, que forma menos de un 10% de agregados homoméricos y fragmentos de moléculas.

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14. Polipéptido-dímero, según la reivindicación 13, que forma menos de un 5% de agregados homoméricos y fragmentos de moléculas.

15. Polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que los monómeros comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 8.

16. Polinucleótido que codifica un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

17. Polinucleótido, según la reivindicación 16, en el que la secuencia del polinucleótido está optimizada en codones para la producción de la proteína codifica en células huésped eucariotas, bacterias, levaduras o células de insecto.

18. Polinucleótido, según las reivindicaciones 16 o 17, que comprende la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la figura 7.

19. Vector de expresión que contiene un polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.

20. Célula huésped que contiene un vector de expresión, según la reivindicación 19.

21. Método para la producción de un polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende cultivar una célula huésped según la reivindicación 20, recuperar el polipéptido-monómero o dímero de dicha célula huésped o del medio de cultivo y su purificación.

22. Composición farmacéutica que contiene un polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones

1 a 15 o un polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.

23. Utilización de un polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o de un 5 polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de la resorción ósea, la hipercalcemia, la caquexia, un tumor, el cáncer, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, o una

10 infección bacteriana o viral.