DÍMEROS DE SGP 130FC MEJORADOS.

Un dímero polipeptídico capaz de inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R y que comprende dos monómeros,

en el cada uno de dichos monómeros comprende (a) una parte extracelular de una molécula de gp130 o (b) una variante o fragmento de dicha parte extracelular capaz de inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R, fusionado con un dominio Fc de una proteína IgG1, y en el que al menos el resto aminoacídico Leu235 de la región bisagra del dominio Fc está remplazado por al menos un resto aminoacídico hidrófilo

La presente invención se refiere a un dímero polipeptídico que comprende dos moléculas de gp130 solubles como se caracteriza en las reivindicaciones. De este modo, se refiere a un dímero polipeptídico capaz de inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R y que comprende dos monómeros en el que cada uno de dichos monómeros comprende 5 (a) una parte extracelular de una molécula de gp130 o (b) una variante o fragmento de dicha parte extracelular capaz de inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R, fusionado con un dominio de Fc de una proteína IgG1 y en el que al menos el resto aminoacídico Leu235 de la región bisagra del dominio Fc está remplazado por al menos un resto aminoacídico hidrófilo. La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que contiene dicho dímero y diversos usos médicos. 10

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La citocina pleiotrópica interleucina-6 (IL-6) muestra un amplio espectro de funciones biológicas entre las son principalmente notables que la estimulación de linfocitos B y la inducción de síntesis proteica de fase aguda en hígado. IL-6 ejerce su actividad en células diana mediante la unión a un receptor de superficie específico de IL-6 (IL-6R). Este complejo receptor/ligando facilita la homodimerización de gp130, la segunda subunidad del complejo receptor de IL-6. La dimerización de gp130 da como resultado la transducción de una señal de IL-6. Formas solubles del IL-6R (sIL-6R) 15 que se generan por dos mecanismos (corte y empalme alternativo y desprendimiento) también son capaces de desencadenar la dimerización de gp130 y señalizar cuando forman complejo con IL-6.

Puesto que la porción citoplásmica del IL-6R no contribuye a la transducción de señal, la señalización por un homodímero gp130 puede inducirse mediante IL-6 en complejo con IL-6R unido a membrana o soluble. La presencia de sIL-6R, sin embargo, conduce a sensibilización hacia al ligando de las células sensibles a IL-6. Además, las células del 20 hibridoma estrictamente dependiente de IL-6 no proliferan en respuesta a cantidades muy bajas de IL-6 cuando el sIL-6R presente en los medios de cultivo se retira continuamente.

Inicialmente descrito como el transductor de señal de interleucina 6, IL-6, IL-11, factor inhibidor de leucemia (LIF), oncostatina M (OSM) y factor neurotrófico ciliar (CNTF). Todas estas citocinas actúan mediante un complejo receptor bi o tripartito en el que la sensibilización se desencadena por homodimerización (para IL-6) o heterodimerización de gp130 25 con LIF-R (para LIF, CT-1, OSM, CLC y CNTF) u OSM-R (para OSM). Estas citocinas pueden mediar de este modo actividades biológicas similares en diversos tejidos.

Mientras que gp130 puede encontrarse en casi todos los tipos celulares, el IL-6R muestra una expresión mucho más restringida. La liberación de sIL-6R por un tipo celular hace a otras células, que sólo expresan gp130, sensibles a IL-6. Este escenario se denomina trans-señalización. De hecho, se han descrito varias actividades celulares que requieren el 30 complejo de sIL-6R e IL-6 y no se ven con IL-6 sola. La proteína gp130 soluble se encuentra en altas concentraciones en plasma humano. Recientemente se ha descrito la citocina de diseño Hyper-LL-6 (H-IL-6), en la que el extremo C terminal de sIL-6R está fusionado covalentemente con el extremo N terminal de IL-6 madura por un enlazador peptídico flexible. Como se ha visto con el complejo de IL-6/sIL-6R, H-IL-6 también actúa en células que sólo expresan gp130. A diferencia de los componentes separados IL-6 y sIL-6R, una concentración de 100 a 1000 veces menor de esta 35 molécula de fusión es suficiente para inducir señales biológicas comparables.

Para el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos, puede ser deseable el bloqueo específico de respuestas de IL-6 dependientes de IL-6R soluble. Dichas enfermedades incluyen resorción ósea, hipercalcemia, caquexia, tumores u otros tipos de cáncer (por ejemplo, cáncer de colon, mieloma múltiple, linfoma, leucemia, enfermedad de Hodgkin), enfermedades autoinmunes (por ejemplo, esclerosis múltiple (EM) o diabetes tipo 1) enfermedades inflamatorias o 40 atópicas (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, asma, psoriasis, sarcoidosis, lupus eritematoso o uveítis), infecciones (por ejemplo, por bacterias, virus, hongos u otros patógenos) así como trastornos endocrinológicos y enfermedades metabólicas o catabólicas (por ejemplo, diabetes tipo 2, obesidad, hiperglucemia o hipercolesterolemia). Se descubrió que, por ejemplo, los dímeros de sgp130 o dímeros de sgp130Fc son útiles para aplicaciones terapéuticas. 45

El problema técnico que subyace la presente invención fue proporcionar dímeros de sgp130Fc mejorados.

La solución de dicho problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Durante los experimentos que condujeron a la presente invención se descubrió que la actividad biológica, capacidad de purificarse y estabilidad de las proteínas de fusión de sgp130Fc dependen significativamente de la composición de aminoácidos de la región bisagra entre la sgp130 y la parte de Fc. Los aminoácidos 234, 235 y 237 50 de la IgG-Fc humana (de acuerdo con la numeración UE) se mutaron para reducir la unión del receptor Fc a este motivo (Duncan y col., Nature (1988), 332: 563-564; Canfield y Morrison, J. Exp. Med. (1991), 173: 1483-1491; Wines y col., J. Immunol. (2000), 164: 5313-5318; Sondermann y col., Nature (2000), 406: 267). Inesperadamente, remplazando Leu235 de la secuencia de tipo silvestre Leu234-Leu235-Gly236-Gly237 con glutamato (Glu, E) o aspartato (Asp, D) y, de este modo, rompiendo el motivo hidrófobo con un aminoácido fuertemente hidrófilo (cargado) la actividad y estabilidad biológicas de 55 las proteínas de fusión sgp130Fc pudo mejorarse. Las mutaciones de las posiciones 234 y 237 aumentan este efecto. El mutante más potente presenta la secuencia Ala234-Glu235-Gly236-Ala237.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Muteínas de la región bisagra de sgp130Fc

La región bisagra inferior de IgG1-Fc humana se modificó por mutagénesis dirigida. La secuencia ideal, como se determinó en los experimentos, es “AEGA” (como se incorpora en el compuesto CR5/18).

Abreviaturas y símbolos: aa, aminoácido o aminoácidos; C, cisteínas que forman los dos puentes disulfuro necesarios 5 para la dimerización de la proteína de fusión de Fc; X, alanina (Ala, A) o fenilalanina (Phe, F); Z, glutamato (Glu, E) o Aspartato (Asp, D).

Figura 2: Curvas de elución de cromatografía de exclusión por tamaño de sgp130Fc de tipo silvestre y CR5/18

CRS/18 muestra una cantidad significativamente reducida de agregados (productos secundarios) en comparación con sgp130Fc de tipo silvestre y, de este modo, un mayor rendimiento de producto no contaminado. 10

Figura 3: Inhibición de la proliferación inducida por IL-6/sIL-6R de células BAF3/gp130 mediante CR5/18 o sgp130Fc de tipo silvestre como se determinó mediante ensayo de MTS de viabilidad celular

CR5/18 es significativamente más activo biológicamente que sgp130Fc de tipo silvestre (wt) en el bloqueo de la proliferación desencadenada por IL-6 100 ng/ml y sIL-6R 50 ng/ml. Esto se refleja por la CI50 de CR5/18 (1), que es aproximadamente la mitad de la CI50 de sgp130Fc (2). Abreviaturas y símbolos: CI50, concentración con eficacia 15 inhibidora del 50%; IL-6, interleucina-6; I/R, IL-6 más sIL-6R; MTS, sustrato que se convierte mediante células metabólicamente activas en un producto de formazán soluble que absorbe a 490 nm; DO, densidad óptica a 490 nm; sIL-6R, receptor de interleucina 6 soluble.

De este modo, la presente invención se refiere a un dímero polipeptídico capaz de inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R como se caracteriza adicionalmente en las reivindicaciones. 20

El término “soluble” como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de gp130 que carece del dominio intracelular y, preferentemente, del dominio transmembrana.

Los dímeros de la presente invención pueden obtenerse por...

1.Un dímero polipeptídico capaz de inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R y que comprende dos monómeros, en el cada uno de dichos monómeros comprende (a) una parte extracelular de una molécula de gp130 o (b) una variante o fragmento de dicha parte extracelular capaz de inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R, 5 fusionado con un dominio Fc de una proteína IgG1, y en el que al menos el resto aminoacídico Leu235 de la región bisagra del dominio Fc está remplazado por al menos un resto aminoacídico hidrófilo.

2. El dímero polipeptídico de la reivindicación 1, en el que el resto aminoacídico hidrófilo es Glu o Asp.

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3. El dímero polipeptídico de la reivindicación 1 ó 2, en el que, además, el resto aminoacídico Leu234 de la región bisagra está remplazado por Phe o Ala.

4. El dímero polipeptídico de la reivindicación 3, en el que los restos aminoacídicos Leu234 y/o Gly237 de la región bisagra están remplazados por el resto aminoacídico Ala. 15

5. El dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la región bisagra comprende el motivo de secuencia de aminoácidos Ala234-Glu235-Gly236-Ala237 en lugar de Leu234-Leu235-Gly236-Gly237.

6. El dímero polipeptídico de la reivindicación 5, en el que la región bisagra comprende la secuencia de aminoácidos 20 Asp221-Lys222-Thr223-His224-Thr225-Cys226-Pr227-Pro228-Cys229-Pro230-Ala231-Pro232-Glu233-Ala234-Glu235-Gly236-Ala237-Pro238-Ser239-Val240.

7. El dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la molécula de gp130 soluble o variante o fragmento de la misma está fusionada directamente con la región bisagra del dominio Fc de la proteína IgG1 25 o mediante un enlazador polipeptídico flexible.

8. El dímero polipeptídico de la reivindicación 7, en el que el enlazador es un enlazador que comprende de 2 a 50 restos aminoacídicos seleccionados independientemente del grupo que consiste en glicina, serina, asparagina, treonina y alanina. 30

9. El dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que uno o más sitios de N-glucosilación están insertados entre la molécula, o variante o fragmento, de gp130 soluble y el dominio Fc.

10. El dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que los monómeros están unidos entre 35 sí a través de un enlace covalente simple, un enlazador peptídico flexible o uno o más puentes disulfuro.

11. El dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que al menos un monómero de dicho dímero está PEGilado.

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12. Un polinucleótido que codifica un monómero del dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

13. Un vector de expresión que contiene un polinucleótido de la reivindicación 12.

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14. Una célula huésped que contiene un vector de expresión de la reivindicación 13.

15. Un procedimiento para producir el dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende cultivar una célula huésped de la reivindicación 14 y recuperar el monómero o dímero de dicha célula huésped o del cultivo. 50

16. Una composición farmacéutica que contiene un dímero polipeptídico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

17. Uso de un dímero polipeptídico como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la 55 preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de resorción ósea, hipercalcemia, caquexia, un tumor u otro tipo de cáncer, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o atópica, una infección, un trastorno endocrinológico o una enfermedad metabólica o catabólica.