Ácido nucleico aislado que codifica el receptor de la interleucina-9 (IL-9) humana seleccionado de entre el grupo consistente en ácido nucleico aislado que codifica el receptor de la interleucina-9 (IL-9) humana caracterizado porque los nucleótidos correspondientes a las posiciones 613 a 641 del receptor de tipo salvaje de IL-9 (SEQ ID NO:

1) han sido suprimidos, ácido nucleico aislado que codifica el receptor de la interleucina-9 (IL-9) humana caracterizado porque los nucleótidos correspondientes a las posiciones 613 a 617 del receptor de tipo salvaje de IL-9 (SEQ ID NO:1) han sido suprimidos, fragmentos de los mismos que contienen la deleción y complementos de los mismos que contienen la deleción

Campo de la Invención

La presente invención describe la variabilidad biológica en el receptor IL-9 (Factor 2 Asociado a Asma) (SEQ ID NO:1) y relaciona estas variantes de secuencias con la sensibilidad al asma, la alergia atópica y trastornos asociados. Además, se describen métodos que emplean receptores variables de IL-9 en el desarrollo de productos farmacéuticos para el asma que depende de la regulación de la actividad de IL-9.

Antecedentes de la Invención

La inflamación es un proceso complejo en el que el sistema de defensa del cuerpo combate entidades extrañas. Aunque la lucha contra entidades extrañas puede resultar necesaria para la supervivencia del cuerpo, algunos sistemas de defensa responden a ellas de forma inadecuada, incluso ante aquellas que son inocuas, y peligrosa y dañan así el tejido circundante en la lucha subsiguiente.

La alergia atópica es un trastorno en el que el fondo genético dicta la respuesta a los estímulos ambientales. En general, el trastorno se caracteriza por un aumento de la capacidad de los linfocitos para producir anticuerpos IgE en respuesta a antígenos ubicuos. La activación del sistema inmune por estos antígenos conduce también a la inflamación alérgica, que puede producirse después de su ingesta, por su penetración en la piel o tras su inhalación. Cuando tiene lugar esta activación inmune y lleva a una inflamación pulmonar, en general este trastorno se clasifica como asma. En esta reacción inflamatoria de las vías aéreas son importantes determinadas células, incluyendo células T así como aquellas que presentan antígenos, células B que producen IgE y mastocitos/basófilos que almacenan mediadores inflamatorios y se unen a IgE, así como eosinófilos que liberan otros mediadores. Estas células inflamatorias se acumulan en el sitio de la inflamación alérgica y los productos tóxicos que liberan contribuyen a la destrucción del tejido relacionado con el trastorno.

Aunque generalmente el asma se define como un trastorno inflamatorio de las vías aéreas, los síntomas clínicos surgen de la obstrucción intermitente del flujo aéreo. Se trata de un trastorno crónico, incapacitante, que parece aumentar en su frecuencia y gravedad.1. Se estima que el 30-40% de la población padece de alergia atópica y un 15% de los niños y un 5% de los adultos de la población padece asma.1 Por tanto, el tratamiento de estos trastornos representa una enorme carga para nuestros recursos de atención sanitaria.

Tanto el diagnóstico como el tratamiento del asma y de sus trastornos relacionados son problemáticos1. En particular, a menudo la evaluación del tejido pulmonar inflamado es difícil y con frecuencia la causa de la inflamación no se puede determinar. Aunque el asma atópica es un trastorno ecogenético, tan sólo recientemente se ha tenido conocimiento de las variantes génicas particulares. Quedan por determinar los métodos para detectar estas variaciones genéticas y su papel en la inflamación, diagnóstico y pronóstico. La técnica necesita el desarrollo de una tecnología para acelerar el diagnóstico del asma atópica que se relaciona específicamente con las variaciones en los genes responsables de la sensibilidad/resistencia a esta enfermedad atópica.

Los tratamientos actuales tienen su propia serie de inconvenientes. Los principales agentes terapéuticos, los agonistas-β, reducen los síntomas, es decir, mejoran transitoriamente las funciones pulmonares, pero no afectan a la inflamación subyacente, de modo que los tejidos pulmonares siguen estando en peligro. Además, el uso constante de agonistas-β resulta en una insensibilización, lo que reduce su eficacia y seguridad2. Los agentes que pueden reducir la inflamación subyacente, los esteroides antiinflamatorios, tienen su propia lista de efectos secundarios conocidos, que van desde la inmunosupresión a la pérdida ósea2.

Debido a los problemas asociados a las terapias convencionales, se han A37

evaluado estrategias alternativas de tratamiento38-39 . La glicoforina , la ciclosporina38 y un fragmento nonapeptídico de IL-226 inhiben todos la proliferación de linfocitos T dependientes de la interleucina-2. Se sabe, sin embargo, que tienen numerosos otros efectos2. Por ejemplo, la ciclosporina se utiliza como inmunosupresor después del transplante de un órgano. Aunque estos agentes pueden representar alternativas a los esteroides en el tratamiento de los asmáticos 36-39, inhiben la proliferación de linfocitos T dependientes de la interleucina-2, así como las funciones inmunes potencialmente críticas asociadas a la homeostasis. En la técnica se necesita una tecnología para acelerar el desarrollo de productos terapéuticos que estén diseñados específicamente para tratar la causa y no los síntomas del asma atópica. Estas terapias representan la vía más apropiada para evitar la toxicidad asociada al tratamiento no específico. Las terapias enfocarían selectivamente una vía aguas abajo de las funciones inmunes, tales como la activación de linfocitos T mediados por IL-2, que es necesaria para el desarrollo del asma y que explicaría la naturaleza episódica del trastorno y su estrecha asociación a la alergia. La naturaleza demuestra que una vía es la diana adecuada para la terapia del asma cuando normalmente existe una variabilidad biológica en la vía y los individuos que muestran tal variabilidad no están inmunocomprometidos o enfermos, excepto en cuanto a sus síntomas de asma atópica.

Debido a las dificultades relacionadas con el diagnóstico y el tratamiento de alergias atópicas, incluyendo el asma, la patofisiología compleja de estos trastornos se está sometiendo a profundo estudio. Aunque estos trastornos son heterogéneos y pueden resultar difíciles de definir, ya que pueden tomar muchas formas, se encuentran ciertas características comunes entre los asmáticos. Como ejemplos de dichas características se incluyen la respuesta anormal a la prueba de la piel al desafío con alérgenos, eosinofilia pulmonar, hiperreactividad bronquial (BHR), reversibilidad broncodilatadora y obstrucción del flujo de aire 3-10. Estas expresiones de las características relacionadas con el asma se pueden estudiar por medio de mediciones cuantitativas o cualitativas.

En muchos casos, los altos niveles de IgE están en correlación con la BHR, respuesta broncoconstrictora fuerte frente a una variedad de estímulos4,6,8,9. Se cree que la BHR refleja la presencia de inflamación en las vías aéreas 6,8 y se considera un factor de riesgo para el asma11-12 . La BHR viene acompañada de inflamación bronquial, incluyendo la infiltración eosinofílica en el pulmón y una diátesis alérgica en individuos asmáticos6,8,13-18.

Numerosos estudios documentan un componente hereditario del asma atópica4,10. Sin embargo, ha resultado difícil interpretar los estudios en familias, ya que la edad y el género influyen significativamente en estos trastornos, así como muchos factores ambientales tales como alérgenos, infecciones virales y contaminantes19-21. Además, debido a que no existe ningún defecto bioquímico conocido asociado a la sensibilidad a estos trastornos, los genes mutantes y sus productos genéticos anormales sólo se pueden reconocer por medio de los fenotipos anómalos que producen.

Las funciones de IL-9 y del receptor de IL-9 (la vía IL-9) se extienden ahora más allá de lo que se reconocían originalmente. Aunque la vía de IL-9 sirve de estimulante del crecimiento de células T, esta citoquina es conocida también por mediar en el crecimiento de progenitores eritroides, células B, mastocitos y timocitos fetales22,23. La vía de IL-9 actúa de forma sinérgica con IL-3, provocando la activación y proliferación de mastocitos24. La vía de IL-9 potencia asimismo la producción inducida por IL-4 de IgE, IgG e IgM por los linfocitos B humanos normales25 y la liberación inducida por IL-4 de IgE e IgG por los linfocitos B murinos26. Se ha demostrado también el papel de la vía de IL-9 en la respuesta inflamatoria a la infección parasitaria en mucosas27,28.

Sin embargo, no se sabe cómo la secuencia del receptor de IL-9 tiene correlación específica con el asma atópica, así como con la hiperreactividad bronquial. Se sabe que IL-9 se une a un receptor específico expresado en la superficie de las células diana23,29,30. El receptor se compone concretamente de dos cadenas de proteínas: una cadena proteica, conocida como receptor de IL9, se une específicamente a IL-9; la otra cadena proteica es compartida en común con el receptor de IL-223. Además, se ha clonado y secuenciado un ADNc que codifica el...

1. Ácido nucleico aislado que codifica el receptor de la interleucina-9 (IL-9) humana seleccionado de entre el grupo consistente en ácido nucleico aislado que codifica el receptor de la interleucina-9 (IL-9) humana caracterizado porque los nucleótidos correspondientes a las posiciones 613 a 641 del receptor de tipo salvaje de IL-9 (SEQ ID NO:1) han sido suprimidos, ácido nucleico aislado que codifica el receptor de la interleucina-9 (IL-9) humana caracterizado porque los nucleótidos correspondientes a las posiciones 613 a 617 del receptor de tipo salvaje de IL-9 (SEQ ID NO:1) han sido suprimidos, fragmentos de los mismos que contienen la deleción y complementos de los mismos que contienen la deleción.

2. Ácido nucleico aislado que codifica el receptor de la interleucina-9 (IL-9) humana según la reivindicación 1, caracterizado porque los nucleótidos correspondientes a las posiciones 613 a 641 del receptor de tipo salvaje de IL-9 (SEQ ID NO:1) han sido eliminados.

3. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento que contiene la deleción codifica una proteína o un péptido que se une a IL-9.

4. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento que contiene la deleción codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33.

5. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos comprende la SEQ ID NO:7.

6. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos consiste en la SEQ ID NO:7.

7. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos comprende la SEQ ID NO:6.

8. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos consiste en la SEQ ID NO:6.

9. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico es ADN o ARN.

10. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 9, caracterizado porque el ADN es ADNc.

11. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 9, caracterizado porque el ARN es ARNm.

5 12. Vector que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Vector según la reivindicación 12 que comprende un plásmido, un cósmido o un virus.

14. Vector según la reivindicación 12 que es un vector recombinante o de 10 expresión.

15. Vector según la reivindicación 12 que comprende además una secuencia reguladora.

16. Vector según la reivindicación 15, caracterizado porque la secuencia

reguladora es un promotor, un sitio de unión ribosómico o un sitio de 15 terminación de la transcripción.

17. Vector según la reivindicación 16, caracterizado porque el promotor se selecciona de entre el grupo consistente en el promotor de citomegalovirus humano, promotor inducible por tetraciclina, promotor de virus de simio, promotor de repeticiones terminales largas del virus de la leucemia murina de Moloney, promotor del virus del tumor mamario murino inducible por glucocorticoides, promotor de la timidina quinasa del herpes, promotores humanos y murinos de la actina, región flanqueante 5' de IL-9 del HTLV-1 y VIH, región flanqueante 5' del receptor de IL-9 humana o de ratón, promotor bacteriano tac y elementos potenciadores de la región de unión de proteínas de andamiaje asociadas al choque térmico en Drosofila (SAR).

18. Célula huésped transformada por el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17.

19. Célula huésped según la reivindicación 18 que es transformada por

30 infección, captación directa, transducción, apareamiento F, microinyección o electroporación.

20. Célula huésped según la reivindicación 18 que se selecciona de entre el grupo consistente en células bacterianas, células de levaduras, células de insectos, células vegetales y células de mamíferos.

21. Célula huésped según la reivindicación 20 que se selecciona de entre el grupo consistente en E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, células CHO, RI-1, B-W, LH, COS-J, COS-7, BSC1, BSC40, BMT10 o S69.

22. Célula huésped según la reivindicación 20, caracterizada porque las células de levadura se seleccionan de entre el grupo consistente en Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula o Torulopsis.

23. Proteína receptora de IL-9 humana aislada codificada por el ácido nucleico de la reivindicación 1.

24. Proteína humana aislada según la reivindicación 23 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:33.

25. Proteína humana aislada según la reivindicación 23 consistente en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:33.

26. Proteína humana aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 caracterizada porque la proteína se une a IL-9.

27. Proteína según la reivindicación 26, caracterizada porque la proteína es soluble.

28. Método para elaborar una proteína que comprende el cultivo de una célula huésped transformada con el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en condiciones en las cuales se expresa la proteína codificada por dicho ácido nucleico.

29. Composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

30. Composición farmacéutica que comprende la proteína según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27.

31. Composición según las reivindicaciones 29 ó 30, caracterizada porque la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

32. Composición según las reivindicaciones 29 ó 30, caracterizada porque la composición se formula para la administración tópica.

33. Composición según las reivindicaciones 29 ó 30, caracterizada porque la composición se formula para la inhalación.

5 34. Composición según las reivindicaciones 29 ó 30, caracterizada porque la composición se formula para la administración sistémica.

35. Composición según las reivindicaciones 29 ó 30, caracterizada porque la composición se formula para la administración intravenosa, intraperitoneal

o intralesional.