Un procedimiento in vitro para detectar un ligando en una muestra,

en el que el ligando comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: (a) los restos de aminoácidos 22-205 de la SEQ ID NO: 52, (b) los restos de aminoácidos 20-200 de la SEQ ID NO: 55, (c) los restos de aminoácidos 22-205 de la SEQ ID NO: 57, (d) los restos de aminoácidos 29-202 de la SEQ ID NO: 60, y (e) los restos de aminoácidos 29-202 de la SEQ ID NO: 62; en el que el procedimiento comprende: poner en contacto la muestra con un receptor heterodímero que comprende un primer polipéptido receptor y un segundo polipéptido receptor; en el que dicho primer polipéptido receptor comprende una secuencia de restos de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a: (i) los aminoácidos 21-223 de la SEQ ID NO: 2; (ii) los aminoácidos 21-226 de la SEQ ID NO: 2; (iii) los aminoácidos 21-223 de la SEQ ID NO: 19; o (iv) los aminoácidos 21-226 de la SEQ ID NO: 19; y en el que dicho segundo receptor comprende el dominio extracelular de CRF2-4; y en el que dicho polipéptido receptor heterodímero se une a dicho ligando; y detectar la unión de dicho ligando a dicho receptor heterodímero

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las hormonas y los factores de crecimiento polipéptidos controlan la proliferación y diferenciación de células de organismos multicelulares. Estas moléculas difusibles permiten que las células se comuniquen entre sí y actúen de forma concertada para formar células y órganos, y que reparen el tejido dañado. Los ejemplos de 5 hormonas y factores de crecimiento incluyen las hormonas esteroideas (p. ej., estrógeno, testosterona), hormona paratiroidea, hormona foliculoestimulante, las interleuquinas, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), eritropoyetina (EPO) y calcitonina.

Las hormonas y los factores de crecimiento influyen en el metabolismo celular por unión a los 10 receptores. Los receptores pueden ser proteínas de membrana integrales que están conectadas a rutas de señalización dentro de la célula, tales como sistemas de segundos mensajeros. Otras clases de receptores son moléculas solubles, tales como los factores de transcripción. Tienen un interés particular los receptores de citocinas, moléculas que promueven la proliferación y/o diferenciación de células. Los ejemplos de citocinas incluyen eritropoyetina (EPO), que estimula el desarrollo de eritrocitos; trombopoyetina (TPO), que estimula el desarrollo de 15 células del linaje de megacariocitos; y factor estimulador de la colonia de granulocitos (G-CSF), que estimula el desarrollo de neutrófilos. Estas citocinas son útiles en la restauración de los niveles normales de células sanguíneas en pacientes que padecen anemia, trombocitopenia y neutropenia o que reciben quimioterapia para el cáncer.

Las actividades in vivo demostradas de estas citocinas ilustran el enorme potencial clínico y la necesidad de otras citocinas, agonistas de citocinas y antagonistas de citocinas. La presente invención aborda estas 20 necesidades proporcionando un nuevo receptor de citocinas hematopoyético, así como composiciones y procedimientos relacionados.

La presente invención proporciona dichos polipéptidos para estos y otros usos que serán evidentes para el experto en la materia a partir de las enseñanzas del presente documento. Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada de la invención. 25

El documento WO 02/20569 describe genes de mamífero, y las correspondientes proteínas y anticuerpos, y sus usos diagnósticos o terapéuticos.

El documento WO 02/44209 describe el receptor de citocina zctyor19.

El documento WO 02/086087 describe moléculas de polinucleótidos y polipéptidos para las citocinas Zcyto20, Zcyto21, Zcyto22, Zcyto24 y Zcyto25. 30

El documento WO 2004/037995 procedimientos para tratar la infección vírica usando IL-28 e IL-29.

El documento WO 2004/074320 describe nuevos objetivos terapéuticos en el cáncer.

El documento WO 03/057711 describe el receptor de citocinas LICR-2.

El documento WO 03/040345 describe un tipo de receptor de citocinas 2 CRF2-13 y los correspondientes polinucleótidos y anticuerpos. 35

La presente invención proporciona un procedimiento in vitro para detectar un ligando en una muestra, en el que el ligando comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) los restos de aminoácidos 22-205 de la SEQ ID NO: 52,

(b) los restos de aminoácidos 20-200 de la SEQ ID NO: 55,

(c) los restos de aminoácidos 22-205 de la SEQ ID NO: 57, 40

(d) los restos de aminoácidos 29-202 de la SEQ ID NO: 60, y

(e) los restos de aminoácidos 29-202 de la SEQ ID NO: 62;

en el que dicho procedimiento comprende poner en contacto la muestra con un receptor heterodímero que comprende un primer polipéptido receptor y un segundo polipéptido receptor;

en el que dicho primer polipéptido receptor comprende una secuencia de restos de aminoácidos que es al menos 45 90% idéntica a:

(i) los aminoácidos 21-223 de la SEQ ID NO: 2;

(ii) los aminoácidos 21-226 de la SEQ ID NO: 2;

(iii) los aminoácidos 21-223 de la SEQ ID NO: 19; o

(iv) los aminoácidos 21-226 de la SEQ ID NO: 19;

en el que dicho segundo polipéptido receptor comprende el dominio extracelular de CRF2-4; y en el que dicho polipéptido receptor heterodímero se une a dicho ligando;

y detectar la unión de dicho ligando a dicho receptor heterodímero. 5

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Antes de exponer la invención con detalle, puede ser útil para su comprensión definir los siguientes términos:

La expresión “marcador de afinidad” se usa en el presente documento para indicar un segmento de polipéptido que se puede unir a un segundo polipéptido para proporcionar la purificación o detección del segundo 10 polipéptido, o proporcionar sitios para la unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, se puede usar cualquier péptido o proteína para el que esté disponible un anticuerpo u otro agente de unión específico, como marcador de afinidad. Los marcadores de afinidad incluyen una porción de polihistidina, proteína A (Nilsson y col., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson y col., Methods Enzymol. 198:3, 1991), glutatión S transferasa (Smith y Johnson, Gene 67:31, 1988), marcador de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 15 1985), sustancia P, péptido FlagTM (Hopp y col., Biotechnology 6:1204-10, 1988), péptido de unión a estreptavidina, u otro epítopo antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Ford y col., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Los ADN que codifican marcadores de afinidad están disponibles en proveedores comerciales (p. ej., Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

La expresión “variante alélica” se usa en el presente documento para indicar cualquiera de dos o más 20 formas alternativas de un gen que ocupa el mismo sitio cromosómico. La variación alélica surge de forma natural por mutación y puede dar lugar al polimorfismo fenotípico en poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (no hay cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos alterada. La expresión variante alélica también se usa en el presente documento para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. 25

Las expresiones “amino terminal” y “carboxilo terminal” se usan en el presente documento para indicar posiciones en los polipéptidos. Cuando el contexto lo permita, estas expresiones se usan con referencia a una secuencia particular o una porción de un polipéptido para indicar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una determinada secuencia situada en el carboxilo terminal con respecto a una secuencia de referencia en un polipéptido está situada próxima al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en 30 el extremo carboxilo del polipéptido completo.

La expresión “pareja de complemento/ anticomplemento” indica restos no idénticos que forman una pareja estable asociada de forma no covalente en condiciones adecuadas. Por ejemplo, la biotina y la avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de una pareja de complemento/anticomplemento. Otras parejas de complemento/anticomplemento de ejemplo incluyen parejas de receptor/ligando, parejas de anticuerpo/antígeno (o 35 hapteno o epítopo), parejas de polinucleótido sentido directo/sentido inverso, y similares. Cuando se desea la posterior disociación de la pareja de complemento/anticomplemento, la pareja de complemento/anticomplemento preferiblemente tienen una afinidad de unión <109 M-1.

La expresión “complementos de una molécula de polinucleótido” es una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de bases complementarias y la orientación inversa comparada con una secuencia de 40 referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3'.

La expresión “secuencia de nucleótidos degenerada” indicaba una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (comparado con una molécula de polinucleótido de referencia que codifica un polipéptido). Los codones degenerados contienen tripletes diferentes de nucleótidos, pero codifican el mismo resto de aminoácido (es decir,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro para detectar un ligando en una muestra, en el que el ligando comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) los restos de aminoácidos 22-205 de la SEQ ID NO: 52,

(b) los restos de aminoácidos 20-200 de la SEQ ID NO: 55,

(c) los restos de aminoácidos 22-205 de la SEQ ID NO: 57, 5

(d) los restos de aminoácidos 29-202 de la SEQ ID NO: 60, y

(e) los restos de aminoácidos 29-202 de la SEQ ID NO: 62;

en el que el procedimiento comprende:

poner en contacto la muestra con un receptor heterodímero que comprende un primer polipéptido receptor y un segundo polipéptido receptor; 10

en el que dicho primer polipéptido receptor comprende una secuencia de restos de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a:

(i) los aminoácidos 21-223 de la SEQ ID NO: 2;

(ii) los aminoácidos 21-226 de la SEQ ID NO: 2;

(iii) los aminoácidos 21-223 de la SEQ ID NO: 19; o 15

(iv) los aminoácidos 21-226 de la SEQ ID NO: 19;

y en el que dicho segundo receptor comprende el dominio extracelular de CRF2-4;

y en el que dicho polipéptido receptor heterodímero se une a dicho ligando; y

detectar la unión de dicho ligando a dicho receptor heterodímero.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho primer polipéptido receptor consiste en 20 una secuencia de restos de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a:

(i) los aminoácidos 21-223 de la SEQ ID NO: 2;

(ii) los aminoácidos 21-226 de la SEQ ID NO: 2;

(iii) los aminoácidos 21-223 de la SEQ ID NO: 19; o

(iv) los aminoácidos 21-226 de la SEQ NO: 19. 25

3. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que el primer polipéptido receptor consiste en una secuencia de restos de aminoácidos seleccionada de:

(i) los aminoácidos 21-223 de la SEQ ID NO: 2;

(ii) los aminoácidos 21-226 de la SEQ ID NO: 2;

(iii) los aminoácidos 21-223 de la SEQ ID NO: 19; o 30

(iv) los aminoácidos 21-226 de la SEQ ID NO: 19.

4. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho segundo polipéptido receptor consiste en el dominio extracelular de CRF2-4.

5. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho receptor heterodímero es un receptor heterodímero soluble. 35

6. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho primer polipéptido receptor comprende además una secuencia de restos de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a:

(i) los aminoácidos 227-249 de la SEQ ID NO: 2; o

(ii) los aminoácidos 227-249 de la SEQ ID NO: 19.

7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho primer polipéptido receptor comprende además una secuencia de restos de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a:

(i) los aminoácidos 250-491 de la SEQ ID NO: 2; o

(ii) los aminoácidos 250-520 de la SEQ ID NO: 19.

8. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho primer polipéptido receptor 5 está fusionado con una cadena pesada de la IgG1.

9. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho segundo polipéptido receptor está fusionado con una cadena ligera kappa humana.

10. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que se marca dicho ligando, y se detecta la unión de dicho ligando detectando dicho marcador. 10

11. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que se marca dicho receptor, y se detecta la unión de dicho ligando detectando dicho marcador.

12. Un procedimiento según la reivindicación 6 o 7, en el que la unión de dicho ligando se detecta detectando una actividad de dicho ligando, en el que dicha actividad se selecciona del grupo que consiste en actividad de proliferación y actividad antivírica. 15

13. Un procedimiento según la reivindicación 6 o 7, en el que detectar dicho ligando es indicativo de una afección patológica seleccionada del grupo que consiste en cánceres y afecciones autoinmunes.

14. Un procedimiento según cualquier reivindicación previa, que comprende además aislar el ligando de la muestra.

15. Un procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicho receptor se inmoviliza sobre un soporte 20 sólido.

16. Un procedimiento in vitro para antagonizar una actividad de un ligando, en el que el ligando comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) los restos de aminoácidos 22-205 de la SEQ ID NO: 52,

(b) los restos de aminoácidos 20-200 de la SEQ ID NO: 55, 25

(c) los restos de aminoácidos 22-205 de la SEQ ID NO: 57,

(d) los restos de aminoácidos 29-202 de la SEQ ID NO: 60, y

(d) los restos de aminoácidos 29-202 de la SEQ ID NO: 62;

en el que dicho procedimiento comprende poner en contacto dicho ligando con un receptor heterodímero soluble que comprende un primer polipéptido receptor y un segundo polipéptido receptor; 30

en el que dicho primer polipéptido receptor comprende una secuencia de restos de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a:

(i) los aminoácidos 21-223 de la SEQ ID NO: 2;

(ii) los aminoácidos 21-226 de la SEQ ID NO: 2;

(iii) los aminoácidos 21-223 de la SEQ ID NO: 19; o 35

(iv) los aminoácidos 21-226 de la SEQ ID NO: 19;

y en el que dicho segundo polipéptido receptor comprende el dominio extracelular de CRF2-4;

en el que dicho polipéptido receptor heterodímero se une a dicho ligando;

y en el que dicha actividad se selecciona de la actividad de proliferación y actividad antivírica.

17. Un procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho segundo polipéptido receptor consiste en 40 el dominio extracelular de CRF2-4.