PROTEINAS DE UNION ESPECIFICAS Y USO DE LAS MISMAS.

Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos activos que reconoce un epítopo de EGFR que se encuentra en células tumorigénicas o hiperproliferativas o células que expresan en exceso EGFR o expresan un EGFR mutante,

donde dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos activos (i) se une a EGFR de tipo salvaje humano unido a la célula sólo cuando el EGFR es amplificado o expresado en exceso; (ii) se une a EGFR de2-7 en un epítopo distinto del péptido de empalme LEEKKONYVVTDH y (iii) se une a un epítopo en la secuencia de los restos 273-501 del EGFR humano de tipo salvaje

Proteínas de unión específicas y usos de las mismas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a miembros de unión específica, concretamente anticuerpos y sus fragmentos, que se unen al receptor del factor de crecimiento epidérmico amplificado (EGFR) y al truncamiento de2-7 EGFR del EGFR. En particular, el epítopo reconocido por los miembros de unión específica, concretamente anticuerpos y sus fragmentos, es intensificado o evidente tras la modificación post-traduccional aberrante. Estos miembros de unión específica son útiles en la diagnosis y el tratamiento del cáncer. Los miembros de unión de la presente invención también se pueden utilizar en terapia combinados con agentes quimioterapéuticos o anti-cancerosos y/o otros anticuerpos o sus fragmentos.

Antecedentes de la invención

El tratamiento de las enfermedades proliferativas, concretamente el cáncer, mediante métodos quimioterapéuticos a menudo depende de la explotación de las diferencias en las células diana en proliferación y otras células normales del organismo humano o animal. Por ejemplo, muchos agentes químicos se diseñan para ser absorbidos por el ADN que replica rápidamente de manera que el proceso de replicación del ADN y de división celular es interrumpido. Otro enfoque consiste en identificar antígenos sobre la superficie de las células tumorales u otras células anómalas que no son expresados normalmente en el tejido humano desarrollado, tales como los antígenos tumorales o los antígenos embrionarios. Tales antígenos pueden ser localizados con proteínas de unión tales como anticuerpos que pueden bloquear o neutralizar el antígeno. Además, las proteínas de unión, incluyendo los anticuerpos y sus fragmentos, pueden liberar un agente tóxico u otra sustancia que sea capaz de activar directa o indirectamente un agente tóxico en el sitio del tumor.

El EGFR es una diana atractiva para la terapia con anticuerpos dirigida a tumores debido a que es sobre-expresado en muchos tipos de tumores epiteliales (27,28). Por otra parte, la expresión de EGFR está asociada con una prognosis pobre en numerosos tipos de tumores incluyendo de estómago, de colon, de vejiga urinaria, de mama, de próstata, de endometrio, de riñón y de cerebro (p. ej., glioma). Por consiguiente, se ha informado sobre numerosos anticuerpos para EGFR en la literatura con varias evaluaciones clínicas en marcha (18, 19, 29). Los resultados de los estudios en los que se utilizan mAb para EGFR en pacientes con cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón de células escuamosas, gliomas cerebrales y astrocitomas malignos han sido esperanzadores. La actividad antitumoral de la mayoría de los anticuerpos para EGFR es potenciada por su capacidad para bloquear la unión al ligando (30, 31). Tales anticuerpos pueden mediar su eficacia a través tanto de la modulación de la proliferación celular como de la funciones inmunitarias dependientes de los anticuerpos (p. ej., activación del complemento). El uso de estos anticuerpos, no obstante, puede estar limitado por la absorción en órganos que tienen niveles endógenos elevados de EGFR tales como el hígado y la piel (18, 19).

Una proporción significativa de tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR (esto es, múltiples copias del gen EGFR) también expresan simultáneamente una versión truncada del receptor (13) conocido como de2-7 EGFR, ?GFR, o ?2-7 (términos utilizados aquí indistintamente) (2). El reordenamiento observado en de2-7 EGFR da como resultado un ARNm maduro en marco que carece de 801 nucleótidos que abarcan los exones 2-7 (6-9). La correspondiente proteína EFGR tiene una deleción de 267 aminoácidos que comprende los restos 6-273 del dominio extracelular y un resto glicina novedoso en la confluencia de la fusión (9). Esta deleción, junto con la inserción de un resto glicina, produce un péptido de empalme único en la interfaz de la deleción (9). Se ha informado de de2-7 EGFR (2) en numerosos tipos de tumores incluyendo glioma, mama, pulmón, ovárico y próstata (1-4). Si bien este receptor truncado no se une al ligando, posee poca actividad constitutiva y confiere una ventaja de crecimiento significativa a las células de glioma desarrolladas como xenoinjertos tumorales en ratones carentes de sistema inmunitario (10) y es capaz de transformar células NIH3T3 (11) y células MCF-7. Los mecanismos utilizados por de2-7 EGFR en células de glioma no están completamente definidos pero se ha informado que incluyen una disminución de la apoptosis (12) y un pequeño aumento de la proliferación (12).

Como la expresión de este receptor truncado está restringida a las células tumorales, ésta representa una diana altamente específica para la terapia con anticuerpos. Por consiguiente, numerosos laboratorios han informado sobre la generación de anticuerpos tanto policlonales (14) como monoclonales (3, 15, 16) específicos para el único péptido de de2-7 EGFR. Una serie de mAb de ratón, aislados después de la inmunización con el péptido de2-7 único, mostraron selectividad y especificidad para el receptor truncado y eligieron como diana los xenoinjertos de2-7 EGFR positivos desarrollados en ratones carentes de sistema inmunitario (3, 25, 32).

No obstante, un defecto potencial de los anticuerpos para de2-7 EGFR es que solamente una proporción de tumores que muestran amplificación del gen EGFR también expresan de2-7 EGFR (5). El porcentaje exacto de tumores que contienen de2-7 EGFR no está completamente establecido, debido a que el uso de técnicas diferentes (esto es PCR versus inmunohistoquímica) y diferentes anticuerpos, ha producido una amplia gama de valores referidos para la frecuencia de su presencia. Los datos publicados indican que aproximadamente 25-30% de los gliomas expresan de2-7 EGFR siendo la expresión más baja en astrocitomas anaplásicos y la más alta en glioblastoma multiforme (6,13,17). Se ha informado de que la proporción de células positivas en los gliomas que expresan de2-7 EGFR oscila entre 37-86% (1). Se encontró que un 27% de los carcinomas de mama y un 17% de los cánceres de pulmón eran positivos para de2-7 EGFR (1, 3, 13, 16). De este modo, cabría esperar que los anticuerpos específicos para de2-7 EGFR fueran útiles solamente en un porcentaje de tumores positivos para EGFR.

De este modo, si bien la evidencia existente de actividad de los anticuerpos para EGFR es esperanzadora, continúan las limitaciones observadas sobre el intervalo de aplicabilidad y eficacia reflejadas antes. Por consiguiente, sería deseable desarrollar anticuerpos y agentes similares que demuestren eficacia con una amplia gama de tumores, y es a la consecución de ese objetivo a la que está dirigida la presente invención.

No se debe considerar que la mención de referencias en la presente memoria represente técnica anterior de la presente invención.

Kuan et al, International Journal of Cancer (2000) 88(6): 962-969 describen un fragmento scfv que reconoce el péptido de empalme en EGFRvIII/de2-7 EGFR que está presente en células tumorales que albergan el mutante por deleción y está ausente en células normales.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos activos que reconoce un epítopo EGFR que se encuentra en células tumorigénicas o hiperproliferativas o células que expresan en exceso EGFR o que expresan un mutante de EGFR, donde dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos activos (i) se une a EGFR de tipo salvaje humano unido a la célula solamente cuando EGFR es amplificado o expresado en exceso; (ii) se une a de2-7 EGFR en un epítopo distinto del péptido de empalme LEEKKGNYVVTDH y (iii) se une a un epítopo en la secuencia de restos 273-501 del EGFR de tipo salvaje humano.

La presente invención proporciona un miembro de unión específico aislado, concretamente un anticuerpo o uno de sus fragmentos, que reconoce un epítopo EGFR que no demuestra ninguna alteración o sustitución en la secuencia de aminoácidos con respecto al EGFR de tipo salvaje y que se encuentra en células tumorigénicas, hiperproliferativas o anormales y no es detectable en células normales o de tipo salvaje (el término "célula de tipo salvaje" según se utiliza en la presente memoria contempla una célula que expresa EGFR endógeno pero no 2-7 EGFR y el término excluye específicamente una célula que expresa en exceso el gen EGFR; el término "tipo salvaje" hace referencia a un genotipo o fenotipo u otra característica presente en una célula normal en lugar de un una célula anormal o tumorigénica). El miembro de unión específica, concretamente un anticuerpo o uno...

1. Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos activos que reconoce un epítopo de EGFR que se encuentra en células tumorigénicas o hiperproliferativas o células que expresan en exceso EGFR o expresan un EGFR mutante, donde dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos activos (i) se une a EGFR de tipo salvaje humano unido a la célula sólo cuando el EGFR es amplificado o expresado en exceso; (ii) se une a EGFR de2-7 en un epítopo distinto del péptido de empalme LEEKKONYVVTDH y (iii) se une a un epítopo en la secuencia de los restos 273-501 del EGFR humano de tipo salvaje.

2. Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos activos comprende un polipéptido que se une al dominio que comprende una secuencia de aminoácidos presentada como los restos 115-123 del SEQ ID NO:2 o dicha secuencia de aminoácidos que contiene una o dos sustituciones en la misma.

3. El anticuerpo o uno de sus fragmentos activos de la reivindicación 2, donde el dominio de unión al polipéptido comprende adicionalmente una secuencia de aminoácidos presentada como una o ambas de las secuencias de los restos 44-54 y 68-83 del SEQ ID NO: 2, o una o ambas de dichas secuencias de los restos que contienen una o dos sustituciones en las mismas.

4. Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos activos comprende un dominio de unión al polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos presentada como los restos 109-117 del SEQ ID NO:4 o dicha secuencia de aminoácidos que contiene una o dos sustituciones en la misma.

5. El anticuerpo o uno de sus fragmentos activos de la reivindicación 2 o 3, que comprende adicionalmente un segundo dominio de unión al polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos presentada como los restos 109-117 del SEQ ID NO:4, o dicha secuencia de aminoácidos que contiene una o dos sustituciones en la misma.

6. El anticuerpo o uno de sus fragmentos activos de la reivindicación 4, donde el dominio de unión al polipéptido comprende adicionalmente una secuencia de aminoácidos presentada como una o ambas de las secuencias de los restos 44-54 y 70-76 del SEQ ID NO: 4, o una o ambas de dichas secuencias de los restos que contienen una o dos sustituciones en las mismas.

7. El anticuerpo o uno de sus fragmentos activos de la reivindicación 5 donde el segundo dominio de unión al polipéptido comprende adicionalmente una secuencia de aminoácidos presentada como una o ambas de las secuencias de los restos 44-54 y 70-76 del SEQ ID NO:4, o una o ambas de dichas secuencias de los restos que contienen una o dos sustituciones en las mismas.

8. El anticuerpo o uno de sus fragmentos activos de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, donde dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos activos comprende la secuencia de polipéptidos expuesta en uno o ambos del SEQ ID NO:2 y el SEQ ID NO:4.

9. El anticuerpo o uno de sus fragmentos activos de la reivindicación 8, donde la secuencia de polipéptidos es expuesta en el SEQ ID NO:2.

10. El anticuerpo o uno de sus fragmentos activos de la reivindicación 8, donde la secuencia de polipéptidos es expuesta en el SEQ ID NO:4.

11. Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el anticuerpo es completamente humano, humanizado o quimerizado.

12. El anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con la reivindicación 11, donde los dominios de unión al anticuerpo son portados por un marco de anticuerpo humano.

13. El anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con la reivindicación 12, donde dicho marco de anticuerpo humano es un marco de anticuerpo IgG1 humano.

14. Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con la reivindicación 12, que es un anticuerpo quimérico o uno de sus fragmentos activos, donde dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos activos comprenden una cadena pesada y una cadena ligera donde la cadena pesada comprende los dominios de unión al anticuerpo presentados como el SEQ ID NO:2 y una región constante de la cadena pesada de IgG1 humana.

15. Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con la reivindicación 12, que es un anticuerpo quimérico o uno de sus fragmentos activos, donde dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos activos comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, donde la cadena ligera comprende los dominios de unión al anticuerpo presentados como el SEQ ID NO:4 y una región constante de la cadena ligera kappa humana.

16. Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 en forma de un anticuerpo F(ab')₂, un fragmento scFv, un fragmento biespecífico, un fragmento triespecífico o un fragmento tetraespecífico.

17. Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que porta una marca detectable o funcional.

18. Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con la reivindicación 17, donde dicha marca es un fármaco unido covalentemente o una radiomarca.

19. El anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con la reivindicación 18, donde dicha radiomarca es una cualquiera de H³, C¹⁴, P³², S³⁵, Cl³⁶, Cr⁵¹, Co⁵⁷, Co⁵⁸, Fe⁵⁹, Y⁹⁰, I¹²¹, I¹²⁴, I¹²⁵, I¹³¹, In¹¹¹, At²¹¹, Au¹⁹⁸, Cu⁶⁷, Ac²²⁵, Bi²¹³, Tc⁹⁹ o Re¹⁸⁶.

20. Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que está pegilado.

21. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo o uno de sus fragmentos activos como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

22. Un método para preparar un anticuerpo o uno de sus fragmentos activos como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, que comprende expresar el ácido nucleico de la reivindicación 21 en condiciones para ocasionar la expresión de dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos activos, y recuperar el anticuerpo o uno de sus fragmentos activos.

23. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, para su uso en un método de tratamiento o diagnosis del cuerpo humano o animal.

24. El uso de un anticuerpo o uno de sus fragmentos activos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención del cancer en un mamífero.

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24, donde dicho cáncer está localizado en o es adyacente al cerebro.

26. El uso de acuerdo con la reivindicación 25, donde dicho cáncer es un cáncer residente en el cerebro seleccionado entre un glioblastoma, meduloblastoma, meningioma, astrocitoma neoplásico y malformación arteriovenosa neoplásica.

27. El uso de acuerdo con la reivindicación 24, donde dicho cáncer es un tumor neural.

28. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, donde dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos activos se administra sistémicamente.

29. Un kit para la diagnosis de un tumor en el que el EGFR es amplificado o expresado en exceso o el EGFR es expresado en forma de una proteína truncada, comprendiendo dicho kit un anticuerpo o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, opcionalmente con reactivos y/o instrucciones para su uso.

30. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o uno de sus fragmentos activos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, y opcionalmente, un vehículo, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

31. Un kit para el tratamiento de un tumor en un paciente humano, que comprende una forma de dosificación farmacéutica de la composición farmacéutica de la reivindicación 30, y una forma de dosificación farmacéutica separada que comprende un agente anticanceroso adicional seleccionado del grupo que consiste en agentes quimioterapéuticos, anticuerpos anti-EGFR, agentes radioinmunoterapéuticos, y sus combinaciones.

32. El kit de la reivindicación 31, donde dichos agentes quimioterapéuticos se seleccionan del grupo que consiste en inhibidores de tirosina quinasa, inhibidores de la cascada de fosforilación, moduladores post-traduccionales, inhibidores del crecimiento o la división celulares (p. ej. anti-mitóticos), inhibidores de la transducción de la señal, y sus combinaciones.

33. El kit de la reivindicación 32, donde dichos inhibidores de la tirosina quinasa se seleccionan del grupo que consiste en AG1478, ZD1839, ST1571, OSI-774, SU-6668, y sus combinaciones.

34. El kit de la reivindicación 31, donde dichos anticuerpos anti-EGFR se seleccionan del grupo que consiste en los anticuerpos anti-EGFR 528, 225, SC-03, D8.3, L8A4, Y10, ICR62, ABX-EGF, y sus combinaciones.

35. Un anfitrión unicelular transformado con una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN o una de sus variantes degeneradas, que codifica el anticuerpo o uno de sus fragmentos activos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, seleccionado del grupo que consiste en