Método in vitro para inducir selectivamente la apoptosis en células diana que expresan DR5,

que comprende la etapas de (a) poner en contacto las células diana con una cantidad terapéutica de un anticuerpo que se une específicamente al receptor DR5 de TRAIL, donde el anticuerpo es un anticuerpo que tiene la misma especificidad de epítopo que el hibridoma de ratón-ratón TRA-8 que tiene el número de acceso a la ATCC PTA-1428, donde dicho anticuerpo, en su forma soluble, tiene actividad inductora de la apoptosis in vivo e in vitro en células diana que expresan DR5 y (b) poner en contacto las célula diana con una cantidad terapéutica de un anticuerpo que se une específicamente a un receptor DR4 de TRAIL, donde el anticuerpo es un anticuerpo que tiene la misma especificidad de epítopo que el hibridoma de ratón-ratón 2E12 que tiene el número de acceso a la ATCC PTA-3798, donde dicho anticuerpo tiene actividad inductora de la apoptosis in vivo e in vitro en células diana que expresan DR4

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo capaz de unirse específicamente a un único tipo de receptor de ligando inductor de apoptosis (a partir de ahora mencionado como "TRAIL") relacionado con el factor de necrosis tumoral anticuerpo monoclonal que induce la

Antecedentes de la invención

TRAIL es un miembro de la familia de proteínas TNF, que también incluye TNF- y el ligando Fas (1). Estas proteínas son potentes inductores de la apoptosis. Hasta le fecha, se han identificado cinco receptores para TRAIL, dos de los cuales, DR4 (TRAIL-R1) y DR5 (TRAIL-R2) (2-7), son capaces de transducir la señal de apoptosis mientras que los otros tres DcR1 (TRAIL-R3), DcR2 (TRAIL-R4), y la osteoprotegerina (OPG) no transducen la señal de apoptosis (8-12). Los cinco receptores para TRAIL comparten homología significativa en sus dominios de unión a ligando extracelulares. Similares a Fas y el receptor I de TNF (a partir de ahora mencionado como "TNFRI"), los segmentos intracelulares tanto de DR4 como de DR5 contienen un dominio de muerte, y transducen una señal de apoptosis a través de una vía que implica la proteína del dominio de muerte asociado a Fas (a partir de ahora mencionado como "FADD") y la caspasa 8 (6,7). Además de transducir la señal de apoptosis, los receptores DR4 y DR5 también pueden activar una vía que implica NFb (6,7).

Las funciones biológicas de TRAIL que se han demostrado

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incluyen la capacidad de TRAIL de inducir de forma selectiva la apoptosis de células tumorales transformadas, siendo las células normales relativamente resistentes a la apoptosis mediada por TRAIL (13-15). Esta selectividad sugiere que, en contraste con el ligando Fas, la administración de TRAIL está asociada con niveles muy bajos de toxicidad como se demuestra por la administración sistémica de TRAIL en un modelo animal sin inducir toxicidad significativa (13). Por tanto, se ha propuesto TRAIL como un potente agente inductor de la apoptosis que sería un agente terapéutico adecuado para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades asociadas con la proliferación celular anormal. También se ha propuesto que TRAIL es un potente agente inductor de la apoptosis que sería adecuado para el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Se ha demostrado que la apoptosis mediada por TRAIL está implicada en la muerte celular inducida por activación de células T, sirviendo de este modo como un mecanismo alternativo para el ligando Fas (16,17). La apoptosis mediada por TRAIL también funciona en la inducción de la apoptosis de células T y otras células inflamatorias (18), y desempeña una tarea en la actividad de eliminación de células NK (19-21), y en la función inmunomoduladora de las células dendríticas (22,23). Por tanto, la apoptosis mediada por TRAIL también puede funcionar en el inmunoprivilegio y la inmunovigilancia.

El sistema receptor de TRAIL es complejo, e incluye al menos dos receptores de muerte, DR4 y DR5, y al menos dos receptores no apoptóticos, DcR1 y DcR2. Todos estos receptores no solamente comparten una elevada homología de secuencia de aminoácidos, sino que también muestran una afinidad de unión similar a TRAIL (2-12). La capacidad de los receptores DcR1 y DcR2 de competir por la unión de TRAIL sin inducir la apoptosis sugiere que pueden actuar como

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receptores señuelo que bloquean o modulan la actividad del ligando TRAIL. Además, se ha informado de que las células no transformadas expresan niveles mayores de receptores señuelo que las células transformadas. Por tanto, se ha propuesto que la modulación diferencial de la expresión de los receptores de muerte y señuelo puede representar un mecanismo regulador clave que determina la susceptibilidad de las células a la apoptosis mediada por TRAIL, pero debido a la ausencia de anticuerpos específicos de receptor (2). Aunque la expresión y función de DR4 y DR5 se han estudiado extensivamente, su progreso se ha visto impedido por la ausencia de anticuerpos monoclonales específicos de receptor. No se ha documentado la expresión en superficie celular de DR5. Se ha informado de que se ha generado un panel de anticuerpos anti-receptor de TRAIL que son capaces de inducir la apoptosis de células de melanoma in vitro pero solamente después de la inmovilización de los anticuerpos, para promover el entrecruzamiento y, en algunos casos, las células requieren cultivo con actinomicina D (24). Se han generado varios anticuerpos anti-DR5 (24). Sin embargo, estos anticuerpos monoclonales anti-DR5 previamente generados tienen baja actividad inductora de la apoptosis in vitro, incluso en condiciones de entrecruzamiento. No se ha informado de actividad in vivo. Estos anticuerpos no se han usado para examinar la expresión en superficie celular de receptores de TRAIL (24). Por tanto, existe la necesidad de un anticuerpo monoclonal selectivo para cada receptor de TRAIL específico que no solamente sea capaz de unirse al receptor de superficie celular sino que también induzca fuertemente la apoptosis de diversos tipos de células anormales, incluyendo células tumorales, tanto in vivo como in vitro sin la necesidad de entrecruzamiento o inmovilización. Dicho anticuerpo no solamente proporcionaría un agente terapéutico potencial sino también una herramienta

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de diagnóstico para el análisis funcional del receptor de TRAIL. Existe la necesidad particular de un anticuerpo específico contra cada uno de los receptores DR4 y DR5 inductores de muerte.

En el desarrollo o progreso de muchas enfermedades, a menudo se da el caso de que las células no se eliminan. En muchas enfermedades autoinmunes y afecciones inflamatorias, las células activadas supervivientes atacan a los tejidos o células normales. Además, el progreso de la tumorigénesis y la formación del pannus proliferativo de artritis reumatoide se caracterizan por la proliferación no revisada de las células. Por tanto, una insuficiente apoptosis conduce al desarrollo de enfermedad, y los usos del ligando inductor de apoptosis o el anticuerpo monoclonal agonista para potenciar la apoptosis se consideran una estrategia terapéutica potencial para eliminar esas células no deseadas.

Por ejemplo, la artritis reumatoide (a partir de ahora mencionada como "RA") es una enfermedad autoinmune humana común. La compresión actual sobre la patofisiología de la RA es que las células T y células B autoinmunes inician una respuesta inflamatoria en las articulaciones, que dirige la hiperproliferación de los sinoviocitos. Como consecuencia de la hiperproliferación de las células sinoviales, se sobre-producen metaloproteinasas (a partir de ahora mencionadas como "MMP"), lo que conduce adicionalmente a la destrucción erosiva del cartílago y el hueso que es característica de la RA (25). Por tanto, el control de la hiperproliferación de las células sinoviales inflamatorias es una etapa clave en el tratamiento de la RA. Los mecanismos moleculares que conducen a la hiperproliferación de las células sinoviales aún son desconocidos. Aunque las células sinoviales hiperproliferativas no son malignas y no están transformadas, muchos estudios han sugerido que comparten algunas

características comunes con las células transformadas (46). Estas células, los llamados "sinoviocitos de apariencia transformada", se caracterizan por un retículo endoplasmático grueso y denso, numerosos núcleos irregulares, y cambios en el esqueleto celular normalmente ahusado. Se ha propuesto que la incorporación de los oncogenes y los genes derivados de virus pueden ser los desencadenantes principales del aspecto transformado de las células sinoviales RA (46).

Al menos dos aspectos de la RA sugieren que la apoptosis mal regulada puede contribuir a la patología y que la provocación terapéutica de la apoptosis puede ser un tratamiento eficaz: el fallo en la eliminación de las células T activadas T sugiere que existe una muerte celular inducida por la activación defectuosa de estas células T, que es un proceso que implica la apoptosis mediada por Fas y la apoptosis mediada por TRAIL, y la naturaleza hiperproliferativa de las células sinoviales RA es un factor contribuyente en las fase tardías de la patofisiología de la RA. De hecho, se ha demostrado que la administración de anticuerpos anti-Fas en la... [Seguir leyendo]

1. Método in vitro para inducir selectivamente la apoptosis en células diana que expresan DR5, que comprende la etapas de

(a) poner en contacto las células diana con una cantidad terapéutica de un anticuerpo que se une específicamente al receptor DR5 de TRAIL, donde el anticuerpo es un anticuerpo que tiene la misma especificidad de epítopo que el hibridoma de ratón-ratón TRA-8 que tiene el número de acceso a la ATCC PTA-1428, donde dicho anticuerpo, en su forma soluble, tiene actividad inductora de la apoptosis in vivo e in vitro en células diana que expresan DR5 y (b) poner en contacto las célula diana con una cantidad terapéutica de un anticuerpo que se une específicamente a un receptor DR4 de TRAIL, donde el anticuerpo es un anticuerpo que tiene la misma especificidad de epítopo que el hibridoma de ratón-ratón 2E12 que tiene el número de acceso a la ATCC PTA-3798, donde dicho anticuerpo tiene actividad inductora de la apoptosis in vivo e in vitro en células diana que expresan DR4.

2. Composición que comprende una combinación de

(a) una cantidad terapéutica de un anticuerpo que se une específicamente a un receptor DR5 de TRAIL, donde el anticuerpo es un anticuerpo que tiene la misma especificidad de epítopo que el hibridoma de ratón-ratón TRA-8 que tiene el número de acceso a la ATCC PTA-1428, donde dicho anticuerpo, en su forma soluble, tiene actividad inductora de la apoptosis in vivo e in vitro en células diana que expresan DR5 y

(b) una cantidad terapéutica de un anticuerpo que se une específicamente a un receptor DR4 de TRAIL, donde el anticuerpo es un anticuerpo que tiene la misma especificidad de epítopo que el hibridoma de ratón-ratón 2E12 que tiene el

número de acceso a la ATCC PTA-3798, donde dicho anticuerpo tiene actividad inductora de la apoptosis in vivo e in vitro en células diana que expresan DR4 para su uso para inducir de forma selectiva la apoptosis en células diana que expresan DR5 y DR4.

3. Composición de la reivindicación 2 que comprende, además, agentes terapéuticos.

4. Composición de la reivindicación 3, en la que el agente

o agentes terapéuticos adicionales son miembros de la familia de TNF.

5. Composición de la reivindicación 4, en la que el miembro o miembros de la familia de TNF son ligandos de CD40, o fragmentos o derivados de los mismos.

6. Composición de la reivindicación 4, en la que el miembro o miembros de la familia de TNF son ligandos de Fas, o fragmentos o derivados de los mismos.

7. Composición de la reivindicación 3, en la que el agente

o agentes terapéuticos adicionales son agentes antiinflamatorios.

8. Composición de la reivindicación 7, en la que el agente

o agentes anti-inflamatorios son agentes anti-inflamatorios no esteroideos.

9. Composición de la reivindicación 8, en la que los agentes anti-inflamatorios no esteroideos son inhibidores de COX-1 o inhibidores de COX-2.

10. Composición de la reivindicación 7, en la que el agente

o agentes anti-inflamatorios son agentes anti-inflamatorios esteroideos.

11. Composición de la reivindicación 3, en la que el agente

o agentes terapéuticos adicionales son agentes antivirales.

12. Composición de la reivindicación 3, en la que el agente

o agentes terapéuticos adicionales son agentes antiretrovirales.

13. Composición de la reivindicación 3, en la que el agente

o agentes terapéuticos adicionales son agentes antioportunistas.

14. Composición de la reivindicación 3, en la que el agente

o agentes terapéuticos adicionales son antibióticos.

15. Composición de la reivindicación 3, en la que el agente

o agentes terapéuticos adicionales son agentes inmunosupresores.

16. Composición de la reivindicación 3, en la que el agente

o agentes terapéuticos adicionales son preparaciones de inmunoglobulina.

17. Composición de la reivindicación 3, en la que el agente

o agentes terapéuticos adicionales son agentes antimalariales.

18. Composición de la reivindicación 3, en la que el agente

o agentes terapéuticos adicionales son fármacos antireumáticos modificadores de la enfermedad.

19. Composición de la reivindicación 3, en la que el agente

o agentes terapéuticos adicionales son citoquinas.

20. Composición de la reivindicación 3, en la que el agente

o agentes terapéuticos adicionales son quimioquinas.

21. Composición de la reivindicación 3, en la que el agente

o agentes terapéuticos adicionales son factores de crecimiento.

22. Composición de la reivindicación 3, en la que el agente terapéutico adicional es un compuesto inductor de la apoptosis y en la que el compuesto inductor de la apoptosis es SN-50 o LY294002.

23. Composición de la reivindicación 2, en la que la célula diana es una célula sinovial de proliferación anormal.

24. Composición de la reivindicación 23, en la que la célula sinovial es una célula sinovial de artritis reumatoide.

25. Composición de la reivindicación 2, en la que la célula diana es una célula inmune activada.

26. Composición de la reivindicación 25, en la que la célula inmune activada es un linfocito activado.

27. Composición de la reivindicación 2, en la que la célula diana es un neutrófilo.

28. Composición de la reivindicación 2, en la que la célula diana es una célula infectada por virus.

29. Composición de la reivindicación 2, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

30. Método de la reivindicación 1 o composición de la reivindicación 2, en la que el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado.