Proteínas de unión específica y uso de las mismas.

Anticuerpo anti-receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) aislado,

en el que dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 164 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 166.

Proteínas de unión específica y uso de las mismas CAMPO DE LA INVENCIÓN

[1] La presente invención se refiere a miembros de unión específica, es decir anticuerpos y sus fragmentos, que se unen al receptor del factor de crecimiento epidérmico amplificado (EGFR) y a la deleción en el marco de los exones 2 a 7 de EGFR, dando lugar a un receptor de EGFR truncado que carece de 267 aminoácidos del dominio extracelular (EGFR de2-7). En particular, el epítopo reconocido por los miembros de unión específica, es decir anticuerpos y sus fragmentos, está aumentado o es evidente tras la modificación post-traduccional aberrante. Estos miembros de unión específica son útiles en el diagnóstico y el tratamiento del cáncer. Los miembros de unión de la presente invención también se pueden utilizar en terapia combinados con agentes quimioterapéuticos o anticancerosos y/o con otros anticuerpos o sus fragmentos.

ANTECEDENTES DE LA TECNOLOGÍA RELACIONADA

[2] El tratamiento de enfermedades prollferatlvas, concretamente el cáncer, mediante métodos quimioterapéuticos a menudo depende de la explotación de las diferencias en las células diana en proliferación y otras células normales del organismo humano o animal. Por ejemplo, se diseñan muchos agentes químicos para ser absorbidos por el ADN replicante rápido, de manera que el proceso de repllcaclón del ADN y de división celular es interrumpido. Otro enfoque consiste en Identificar antígenos sobre la superficie de las células tumorales u otras células anómalas que no son expresados normalmente en el tejido humano desarrollado, tales como los antígenos tumorales o antígenos embrionarios. Dichos antígenos pueden ser localizados con proteínas de unión, tales como anticuerpos que pueden bloquear o neutralizar el antígeno. Además, las proteínas de unión, Incluyendo los anticuerpos y sus fragmentos, pueden liberar un agente tóxico u otra sustancia que sea capaz de activar directa o Indirectamente un agente tóxico en el sitio de un tumor.

[3] El EGFR es una diana atractiva para la terapia con anticuerpos dirigida a tumores debido a que se sobreexpresa en muchos tipos de tumores epiteliales (Voldborg et al. (1997). Epidemial growth factor receptor (EGFR) and EGFR mutations, functlon and possible role ¡n cllnlcal triáis. Ann Oncol. 8, 1197-26; den Eynde, B. y Scott, A. M. Tumor Antigens. In: P. J. Delvesy I. M. Roltt(eds.), Encyclopedia of Immunology, Segunda Edición, pág. 2424-31. London: Academic Press (1998)). Además, la expresión del EGFR está asociada con una prognosis pobre en numerosos tipos de tumores incluyendo de estómago, de colon, de vejiga urinaria, de mama, de próstata, de endometrio, de riñón y de cerebro (por ejemplo, glloma). Por consiguiente, se han descrito numerosos anticuerpos para EGFR en la literatura con varias evaluaciones clínicas en marcha (Baselga et al. (2) Phase I Studies of Anti- Epidermal Growth Factor Receptor Chimeric Antibody C225 Alone and in Combination With Cisplatin. J. Clin. Oncol. 18, 94; Faillot et al. (1996): A phase I study of an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody for the treatment of malignant gliomas. Neurosurgery. 39, 478-83; Seymour, L. (1999) Novel anticancer agents in development: exciting prospects and new challenges. Cáncer Treat. Rev. 25, 31-12)).

[4] Los resultados de los estudios en los que se utilizan mAb para EGFR en pacientes con cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón de células escamosas, gliomas cerebrales y astrocitomas malignos han sido esperanzadores. La actividad antitumoral de la mayoría de los anticuerpos para EGFR es potenciada por su capacidad para bloquear la unión al ligando (Sturgis et al. (1994) Effects of antiepidermal growth factor receptor antibody 528 on the proliferation and differentiation of head and neck cáncer. Otolaryngol. Head Neck. Surg. 111, 633-43; Goldstein et al. (1995) Biological efficacy of a chimeric antibody to the epidemial growth factor receptor in a human tumor xenograft model. Clin. Cáncer Res. 1, 1311-8). Dichos anticuerpos pueden mediar su eficacia a través tanto de la modulación de la proliferación celular como de las funciones inmunitarias dependientes de los anticuerpos (por ejemplo, activación del complemento). El uso de estos anticuerpos, no obstante, puede estar limitado por la absorción en órganos que tienen niveles endógenos elevados de EGFR, tales como el hígado y la piel (Baselga et al., 2; Faillot et al., 1996).

[5] Una proparte significativa de tumores que contienen amplificaciones del gen de EGFR (es decir, múltiples copias del gen de EGFR) también expresan simultáneamente una versión truncada del receptor (Wikstrand et al. (1998) The class III variant of the epidermal growth factor receptor (EGFR): characterization and utilization as an immunotherapeutic target. J. Neurovirol. 4, 148-158) conocida como EGFR de2-7, AEGFR, o A2-7 (términos utilizados aquí indistintamente) (Olapade-Olaopa et al. (2) Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cáncer. Br. J. Cáncer. 82, 186-94)). El reordenamiento observado en EGFR de2-7 da como resultado un ARNm maduro en el marco que carece de 81 nucleótidos que abarcan los exones 2-7 (Wong et al. (1992) Structural alterations of the epidermal growth factor receptor gene in human gliomas. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 89, 2965-9; Yamazaki et al. (199) A deletion mutation within the ligand binding domain is responsible for activation of epidermal growth factor receptor gene in human brain tumors. Jpn. J. Cáncer Res. 81, 773-9; Yamazaki et al. (1988) Amplification of the structurally and functionally altered epidermal growth factor receptor gene (c-erbB) in human brain tumors. Mol. Cell Biol. 8, 1816-2; Sugawa et al. (199) Identical splicing of aberrant epidermal growth factor receptor transcripts from amplified rearranged genes in human glioblastomas. Proc.

Nati. Acad. Sc¡. U.S.A. 87, 862-6)). La correspondiente proteína EFGR tiene una deleción de 267 aminoácidos que comprende los residuos 6-273 del dominio extracelular y un residuo de glicina nuevo en la confluencia de la fusión (Sugawa et al., 199). Esta deleción, junto con la inserción de un residuo glicina, produce un péptido de empalme único en la interfaz de la deleción (Sugawa et al., 199).

[6] Se ha descrito EGFR de2-7 en numerosos tipos de tumores incluyendo glioma, mama, pulmón, ovárico y próstata (Wikstrand et al. (1997) Cell surface localization and density of the tumor-associated variant of the epidermal growth factor receptor, EGFRvill. Cáncer Res. 57, 413-4; Olapade-Olaopa et al. (2) Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cáncer. Br. J. Cáncer. 82, 186-94; Wikstrand, et al. (1995) Monoclonal antibodies against EGFRvill in are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cáncer Res. 55, 314-8; Garda de Palazzo et al. (1993) Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell lung carcinomas. Cáncer Res. 53, 3217-2)). Aunque este receptor truncado no se une al ligando, posee poca actividad constitutiva y confiere una ventaja de crecimiento significativa a las células de glioma desarrolladas como xenoinjertos tumorales en ratones desnudos (Nishikawa et al. (1994) A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7727-31) y es capaz de transformar células NIH3T3 (Batra et al. (1995) Epidermal growth factor ligand independent, unregulated, cell-transforming potential of a naturally occurring human mutant EGFRvill gene. Cell Growth Differ. 6, 1251-9) y células MCF-7. Los mecanismos celulares utilizados por EGFR de2- 7 en células de glioma no están completamente definidos pero se ha descrito que incluyen una disminución de la apoptosls (Nagane et al. (1996) A common mutant epidermal growth factor receptor confers enhanced tumorigenicity on human glioblastoma cells by increasing proliferation and reducing apoptosis. Cáncer Res. 56, 579-86) y un pequeño aumento de la proliferación (Nagane et al. 1996).

[7] Como la expresión de este receptor truncado está restringida a las células tumorales, representa una diana altamente específica para la terapia con anticuerpos. Por consiguiente, numerosos laboratorios han informado sobre la generación de anticuerpos tanto policlonales (Humphrey et al. (199) Anti-synthetic peptide antibody reacting at the fusión junction of deletion mutant epidermal growth factor receptors in human glioblastoma. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 87, 427-11) como monoclonales (Wikstrand et al. (1995) Monoclonal antibodies against EGFRvill are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas; Okamoto et al. (1996) Monoclonal... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo anti-receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) aislado, en el que dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 164 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 166.

2. Anticuerpo aislado, según la reivindicación 1, en el que la reglón variable de cadena pesada está unida en su extremo C-terminal a una región constante de cadena pesada de isotipo IgG.

3. Anticuerpo aislado, según la reivindicación 2, en el que dicho isotipo de IgG es un ¡sotipo lgG1.

4. Anticuerpo aislado, según la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el que la región variable de cadena ligera está unida en su extremo C-terminal a una reglón constante de cadena ligera kappa.

5. Anticuerpo aislado, según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 43.

6. Anticuerpo aislado, según la reivindicación 1 o la reivindicación 5, en el que dicho anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 48.

7. Anticuerpo aislado, según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es la forma de un anticuerpo F(ab)2, fragmento scFv, diacuerpo, triacuerpo o tetracuerpo.

8. Anticuerpo aislado, según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además un marcador detectable o funcional.

9. Anticuerpo aislado, según la reivindicación 8, en el que dicho marcador detectable o funcional es un fármaco unido covalentemente.

1. Anticuerpo aislado, según la reivindicación 8, en el que dicho marcador funcional es un fármaco cltotóxico.

11. Anticuerpo aislado, según la reivindicación 8, en el que dicho marcador detectable es un marcador radioactivo.

12. Anticuerpo aislado, según la reivindicación 8, en el que dicho marcador radioactivo se selecciona del grupo que consiste en 3H, 14C, 32P, 35S, 36CI, 51Cr, 58Co, 59Fe, 9Y, 121l, 124l, 125l, 131l, 111ln, 211At, 198Au, 67Cu, 225Ac, 213B¡, "Te y 186Re.

13. Anticuerpo aislado, según la reivindicación 8, en el que dicho marcador detectable es un agente formador de imágenes.

14. Anticuerpo aislado, según la reivindicación 13, en el que dicho agente formador de imágenes es un agente potenciador de las imágenes de resonancia magnética.

15. Anticuerpo aislado, según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que dicho anticuerpo aislado está pegilado.

16. Kit para el diagnóstico de un tumor en el que EGFR se expresa de manera aberrante o EGFR se expresa en forma de una proteína truncada, en el que el kit comprende el anticuerpo aislado, según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, y en el que el kit comprende opcionalmente reactivos y/o instrucciones para su uso.

17. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo aislado, según cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

18. Composición farmacéutica, según la reivindicación 17, que comprende además un agente contra el cáncer seleccionado del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un anticuerpo anti-EGFR, un agente radioinmunoterapéutico y combinaciones de los mismos.

19. Composición farmacéutica, según la reivindicación 18, en la que dicho agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de tirosina quinasa, un inhibidor de la cascada de fosforilación, un modulador post-traduccional, un inhibidor del crecimiento o división celular, un antimitótico, un inhibidor de la transducción de señales, y combinaciones de los mismos.

2. Composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 17-19, para utilizar en la prevención y/o tratamiento del cáncer en mamíferos.

21. Composición farmacéutica para utilizar, según la reivindicación 2, en el que dicho cáncer es un cáncer que reside en el cerebro que produce EGFR expresado de manera aberrante en mamíferos.

22. Composición farmacéutica para utilizar, según la reivindicación 2, en el que dicho cáncer es un cáncer que reside en el cerebro seleccionado del grupo que consiste en glioblastomas, meduloblastomas, meningiomas, astrocitomas neoplásicos y malformaciones arteriovenosas neoplásicas.

23. Composición farmacéutica para utilizar, según la reivindicación 2, en el que dicho cáncer es un tumor sólido primario o secundario.

24. Composición farmacéutica para utilizar, según la reivindicación 2, en el que dicho cáncer es un tumor de glioma.

25. Composición farmacéutica para utilizar, según la reivindicación 2, en el que dicho cáncer es un tumor seleccionado del grupo que consiste en un tumor de mama, un tumor de pulmón, un tumor de próstata, un tumor de vejiga, un tumor de cabeza y un tumor de cuello.

26. Composición farmacéutica para utilizar, según cualquiera de las reivindicaciones 2-25, a utilizar en combinación con un segundo agente.

27. Composición farmacéutica para utilizar, según la reivindicación 26, en el que dicho segundo agente se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de tirosina quinasa, doxorubicina, temozolomida, cisplatino, carboplatino, nitrosoureas, procarbazina, vincristina, hidroxiurea, 5-fluorouracilo, citosina arabinósido, ciclofosfamida y epipodofilotoxina, carmustina, lomustina.

28. Composición farmacéutica para utilizar, según la reivindicación 2, a utilizar en combinación con temozolomida.

29. Huésped unicelular transformado con una molécula de ADN recombinante que codifica un anticuerpo aislado, según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, opcionalmente en el que el huésped unicelular se selecciona del grupo que consiste en células de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, levaduras, CHO, YB/2, NSO, SP2/, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC4 y BMT1, células vegetales, células de insectos y células humanas en cultivo de tejidos.

3. Inmunoconjugado que comprende un agente citotóxico y un anticuerpo aislado, según cualquiera de las reivindicaciones 1-15.