ANTICUERPOS CONTRA GM-CSF QUIMÉRICOS.

[0001] Esta invención se refiere al campo de la inmunología molecular en general, y a vectores útiles para la expresión de proteínas, en especial anticuerpos, tales como anticuerpos humanos, humanizados y quiméricos, así como a proteínas de fusión que incorporan el anticuerpo y una proteína o fragmento de proteína, en células eucariotas, en particular células de mamíferos. Los anticuerpos y las proteínas de fusión resultantes también son una característica de la invención. Antecedentes y técnica anterior [0002] Un problema grave con el uso de anticuerpos murinos para aplicaciones terapéuticas en seres humanos, es que producen rápidamente una respuesta humana dirigida contra IgG de ratón (HAMA) que reduce la eficacia del anticuerpo en los pacientes, e impide la administración continuada de los mismos. Surgen problemas paralelos con la administración de anticuerpos de otras especies no humanas. Un procedimiento para superar este problema es generar los llamados anticuerpos quiméricos. Estos pueden comprender regiones variables murinas y regiones constantes humanas (Boulianne y col. (1984) Nature 312(5995): 643-646). Aunque los anticuerpos quiméricos contienen secuencias murinas y pueden producir una respuesta dirigida contra IgG de ratón en seres humanos (LoBuglio y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(11): 4220-4224), los ensayos con anticuerpos quiméricos en el campo de las enfermedades hematológicas (p. ej., linfoma no Hodgkin; Witzig y col. (1999) J. Clin. Oncol. 17(12): 3793-3803.) o enfermedades autoinmunitarias (p. ej., artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino crónica; Van den Bosch y col., Lancet 356(9244):1821-2 (2000) han llevado a la aprobación de la FDA y demuestran que estas moléculas tienen un potencial y eficacia clínicas significativas. [0003] Estudios recientes han indicado que el factor de crecimiento estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) tiene una función en el desarrollo de la artritis reumatoide (AR) (Cook, y col., Arthritis Res. 2001, 3:293-298) y posiblemente otras enfermedades y afecciones inflamatorias. Por lo tanto, sería interesante desarrollar un fármaco que bloqueara el GM-CSF y su efecto en las células. [0004] Los anticuerpos monoclonales murinos que son específicos para el GM-CSF humano y que neutralizan su actividad in vitro, se han identificado y caracterizado previamente (Dempsey y col., Hybridoma 9:545-558). [0005] La presente invención se refiere a un anticuerpo quimérico, que se dirige a la molécula de GM-CSF, que tiene capacidad de bloqueo. [0006] El mayor uso de anticuerpos quiméricos en aplicaciones terapéuticas ha creado la necesidad de vectores de expresión que produzcan de forma eficaz rendimientos altos de anticuerpos quiméricos en células eucariotas, tales como células de mamíferos, que son preferidas para la producción. La presente invención proporciona vectores de expresión nuevos, células huésped transformadas y procedimientos para producir anticuerpos quiméricos en células de mamíferos, así como los propios anticuerpos y las proteínas de fusión que los contienen. Breve descripción de las figuras [0007] La figura 1 muestra la unión del anticuerpo quimérico dirigido contra GM-CSF recombinante por transferencia Western. La figura 2 muestra la unión del anticuerpo por ELISA. ES 2 365 606 T3 La figura 3 muestra el efecto de bloqueo del anticuerpo en el crecimiento de células TF-1 dependiente de GM-CSF. La figura 4 muestra el efecto de bloqueo del anticuerpo en el crecimiento de células AML-193 dependiente de GM­ CSF. La figura 5 muestra los resultados de un ensayo que prueba el efecto de aumentar la concentración de anticuerpos 19/2 murinos o quiméricos en el crecimiento de células TF-1 en presencia de una cantidad constante de GM-CSF humano. La figura 6 es similar al experimento de la figura 5, pero usa las células AML-153. 2 La figura 7 muestra un mapa esquemático de los dos vectores de expresión usados para preparar los anticuerpos recombinantes. [0008] La presente invención proporciona anticuerpos para GM-CSF quimerizados como se define en las reivindicaciones 1 y 2. La invención también proporciona los vectores de expresión como se definen en las reivindicaciones 3-6. Estos vectores de expresión son útiles para la expresión de los anticuerpos quimerizados de la invención. [0009] Pueden expresarse tanto las cadenas ligeras como las cadenas pesadas. Los vectores de expresión pueden comprender una secuencia del promotor/potenciador del factor de elongación humano 1 (EF1), una secuencia del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) (patente de EE.UU. nº 4.937.190), una secuencia de nucleótidos que confiere resistencia a la neomicina a una célula que contenga el vector de expresión, y una secuencia de nucleótidos bajo el control de un promotor del virus de simio 40 (SV40) que confiere resistencia a la ampicilina a una célula que contenga el vector de expresión. En una realización preferida, la secuencia del promotor/potenciador de EF1 está en la dirección 5 y adyacente a una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera quimérica. [0010] El vector de expresión puede contener una secuencia de nucleótidos que codifica cualquier cadena ligera de inmunoglobulina. La región variable de la cadena ligera puede ser de origen murino y la región constante de la cadena ligera puede ser la kappa humana o lambda humana. La región variable de la cadena ligera quimérica puede derivar de un anticuerpo murino que se une a GM-CSF o CD-30 o G250, en especial a las formas humanas de estas moléculas. [0011] También se describe en el presente documento un vector de expresión adicional útil en la expresión de proteínas, tales como anticuerpos, en especial anticuerpos totalmente humanos, humanizados o quiméricos, y proteínas de fusión que los contienen. Este vector de expresión difiere del vector de expresión descrito antes en que en lugar de la secuencia de resistencia a la neomicina descrita antes, comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la dihidrofolato reductasa o dhfr, que genera resistencia contra el marcador de selección metotrexato bien conocido. Dicho vector de expresión puede contener secuencias de nucleótidos que codifican cualquier anticuerpo o parte del mismo, tal como las cadenas pesada o ligera de anticuerpos totalmente humanos, humanizados o quiméricos. Puede ser expresada una cadena pesada en la que la región variable es de origen murino y la región constante de la cadena pesada es la IgG1 humana. La región variable de la cadena pesada quimérica puede derivar de un anticuerpo murino que se une a CD-30, GM-CSF o G250, preferiblemente las formas humanas de estos. [0012] En otra realización, la presente invención proporciona células huésped transformadas o transfectadas con uno cualquiera de los vectores de expresión de la presente invención. Una célula huésped, preferiblemente una célula eucariota, más preferiblemente una célula humana, se puede transformar o transfectar con un vector de expresión que comprende una cadena ligera de inmunoglobulina quimérica y un vector de expresión que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica. Se pueden usar células procariotas y eucariotas, tales como células de mamíferos, células de insecto, células bacterianas o fúngicas. La célula huésped puede ser una célula humana o de ovario de hámster chino (CHO). [0013] En el presente documento se describen procedimientos para la producción recombinante de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina quimérica, que comprenden la etapa de cultivar una célula huésped transformada o transfectada. Estos procedimientos pueden comprender además el aislamiento de la cadena ligera o pesada de inmunoglobulina quimérica. [0014] En el presente documento se describen procedimientos para la producción recombinante de una inmunoglobulina totalmente humana, humanizada o quimérica, que comprende cultivar una célula huésped que se ha transformado o transfectado con un vector de expresión que comprende una cadena ligera de inmunoglobulina quimérica y un vector de expresión que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica, o un vector de expresión que codifica ambas cadenas. Estos procedimientos pueden comprender además el autoensamblaje de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina y el aislamiento de la inmunoglobulina quimérica. Se conocen procedimientos para llevar a cabo esto en la materia. [0015] En el presente documento se describe la cadena ligera, la cadena pesada de inmunoglobulina quimérica o la inmunoglobulina quimérica ensamblada producida por los procedimientos descritos antes. En el presente documento se describen composiciones que comprenden la cadena ligera, la cadena pesada de inmunoglobulina quimérica o la inmunoglobulina quimérica ensamblada y un vehículo... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo específico para GM-CSF quimerizado que consiste en una cadena pesada, cuya secuencia de aminoácidos consiste en los aminoácidos codificados por los nucleótidos 1357-1764 de la SEQ ID NO: 36, concatenada con la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1839-2825 de la SEQ ID NO: 36, y una cadena ligera. 2. Un anticuerpo específico para GM-CSF quimerizado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos codificados por los nucleótidos 1357-1752 de la SEQ ID NO: 35, concatenada con la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1886­ 2203 de la SEQ ID NO: 35. 3. Vectores de expresión, en los que un primer vector de expresión comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una cadena pesada del anticuerpo específico para GM-CSF quimerizado de la reivindicación 1, operativamente unida a un promotor, y un segundo vector de expresión comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una cadena ligera del anticuerpo específico para GM-CSF quimerizado, operativamente unida a un promotor. 4. Vectores de expresión de acuerdo con la reivindicación 3, en los que el primer vector de expresión consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 36. 5. Vectores de expresión de acuerdo con la reivindicación 3 o reivindicación 4, en los que la cadena ligera es una cadena ligera de acuerdo con la reivindicación 2. 6. Vectores de expresión de acuerdo con la reivindicación 5, en los que el segundo vector de expresión consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 35. 7. Una célula recombinante, transformada o transfectada con el primer y el segundo vector de expresión de la reivindicación 3 ó 4. 8. Una célula recombinante, transformada o transfectada con el primer y el segundo vector de expresión de la reivindicación 5 ó 6. 9. La célula recombinante de la reivindicación 7 u 8, en la que dicha célula es de mamífero. 10. La célula recombinante de la reivindicación 9, en la que dicha célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino. 131 ES 2 365 606 T3 132 ES 2 365 606 T3 133 ES 2 365 606 T3 134 ES 2 365 606 T3 ES 2 365 606 T3 136 ES 2 365 606 T3 137 ES 2 365 606 T3 138