PROCEDIMIENTO DE CLASIFICACION OPTICA.
Procedimiento para aislar uno o más elementos genéticos según un cambio en las propiedades ópticas de los mismos,
en el que se define un elemento genético como que comprende un ácido nucleico que codifica un producto génico que presenta una actividad deseada unido a una microperla y la expresión del ácido nucleico puede resultar, directa o indirectamente, en la modificación de una propiedad óptica del elemento genético, que comprende las etapas siguientes:
(a) compartimentar los elementos genéticos en microcápsulas;
(b) expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas;
(c) modificar los elementos genéticos dentro de las microcápsulas mediante
(i) la unión del producto génico deseado directa o indirectamente a un ligando que es parte del elemento genético, dentro de la microcápsula; o
(ii) la conversión de un sustrato que es parte del elemento genético mediante la actividad del producto génico deseado dentro de la microcápsula, directa o indirectamente, en un producto que permanece como parte del elemento genético; o
(iii) la utilización de la actividad del producto génico deseado directa o indirectamente para generar un producto dentro de la microcápsula que se acompleja posteriormente con el elemento genético y permite su aislamiento;
(d) opcionalmente modificar además los elementos genéticos fuera de las microcápsulas para provocar un cambio en sus propiedades ópticas; y
(e) clasificar los elementos genéticos que producen el/los producto/s génico/s que presentan la actividad deseada según dicho cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W0000030GB.
Solicitante: MEDICAL RESEARCH COUNCIL.
Nacionalidad solicitante: Reino Unido.
Dirección: 20 PARK CRESCENT,LONDON W1N 4AL.
Inventor/es: TAWFIK, DAN MRC LABORATORY OF MOLECULAR BIOLOGY, GRIFFITHS,ANDREW,MRC LAB. OF MOLECULAR BIOLOGY, SEPP,ARMIN.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 11 de Noviembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/10C12
- C12N15/10C8
- C12Q1/68A8
Clasificación PCT:
- C12N15/10 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Clasificación antigua:
- C12N15/10 C12N 15/00 […] › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
- C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
![PROCEDIMIENTO DE CLASIFICACION OPTICA.](https://patentados.com/img/2010/03/procedimiento-de-clasificacion-optica.1.jpg)
Fragmento de la descripción:
Procedimiento de clasificación óptica.
La presente invención se refiere a procedimientos para su utilización en la evolución in vitro de bancos moleculares. En particular, la presente invención se refiere a procedimientos de clasificación de ácidos nucleicos que codifican productos génicos en los que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado están relacionados por compartimentación.
La evolución requiere la generación de diversidad genética (diversidad en ácidos nucleicos) seguida de la clasificación de los ácidos nucleicos que produzcan características beneficiosas. Debido a que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado de un organismo están relacionados físicamente (estando alojados los ácidos nucleicos dentro de las células que codifican) múltiples rondas de mutación y clasificación pueden dar como resultado la supervivencia progresiva de organismos con buen estado físico en aumento. Los sistemas para la rápida evolución de los ácidos nucleicos o las proteínas simulan in vitro ventajosamente este proceso a nivel molecular en el que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado están relacionados y la actividad del producto génico es seleccionable.
Los avances recientes en biología molecular han permitido seleccionar conjuntamente algunas moléculas según sus propiedades junto con los ácidos nucleicos que las codifican. Los ácidos nucleicos seleccionados pueden ser clonados posteriormente para análisis o utilización posterior, o ser sometidos a rondas adicionales de mutación y clasificación.
Es frecuente en estos procedimientos la creación de grandes bancos de ácidos nucleicos. Las moléculas con las características (actividad) deseadas pueden aislarse mediante regímenes de clasificación que seleccionan la actividad deseada del producto génico codificado, tal como una actividad bioquímica o biológica deseada, por ejemplo la actividad de unión.
La tecnología de exposición en fagos ha tenido mucho éxito proporcionando un vehículo que permite la clasificación de una proteína expuesta proporcionando el enlace esencial entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado (Smith, 1985; Bass et al., 1990; McCafferty et al., 1990; para estudio véase Clackson y Wells, 1994). Las partículas de fago filamentoso actúan como concentrados genéticos para exposición con proteínas en el exterior y los elementos genéticos que les codifican en el interior. El enlace fuerte entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado es un resultado del montaje del fago dentro de las bacterias. Ya que las bacterias individuales se infectan raramente al multiplicarse, en la mayoría de los casos todos los fagos producidos a partir de una bacteria individual serán portadores del mismo elemento genético y expondrán la misma proteína.
Sin embargo, la exposición en fagos se basa en la creación de bancos de ácido nucleico in vivo en las bacterias. Por lo tanto, la limitación práctica sobre el tamaño del banco permitido por la tecnología de exposición en fagos es del orden de 107 a 1011, aún aprovechándose de los vectores del fago ? con replicones de fago filamentoso escindibles. La técnica ha sido aplicada principalmente a la clasificación de moléculas con actividad de unión. Se ha aislado un pequeño número de proteínas con actividad catalítica utilizando también ésta técnica, sin embargo, la clasificación no fue directamente para la actividad catalítica deseada, sino para la unión a un análogo del estado de transición (Widersten y Mannervik, 1995) o la reacción con un inhibidor suicida (Soumillion et al., 1994; Janda et al., 1997). Más recientemente ha habido algunos ejemplos en enzimas seleccionadas utilizando la exposición en fagos mediante la formación del producto (Atwell & Wells, 1999; Demartis et al., 1999; Jestin et al., 1999; Pederson et al., 1998), pero en todos estos casos la clasificación no fue para recambio múltiple.
Se han seleccionado ligandos de péptido específicos para la unión a receptores por clasificación de afinidad utilizando grandes bancos de péptidos unidos al terminal C del represor Lacl de lac (Cull et al., 1992). Cuando se expresa en E. coli la proteína represora une físicamente el ligando al plásmido codificador uniendo a una secuencia del operador lac en el plásmido.
Se ha descrito también un sistema de exposición polisómico enteramente in vitro (Mattheakis et al., 1994; Hanes y Pluckthun, 1997) en el que los péptidos nacientes se acoplan físicamente a través del ribosoma al ARN que les codifica. Se ha descrito también un sistema alternativo, enteramente in vitro para enlazar el genotipo al fenotipo realizando fisiones ARN-péptido (Roberts y Szostak, 1997; Nemoto et al., 1997).
Sin embargo, el alcance de los sistemas anteriores está limitado a la clasificación de proteínas y además no permite la clasificación directa para otras actividades que la unión, por ejemplo la actividad catalítica o reguladora.
La clasificación y evolución del ARN in vitro (Ellington y Szostak, 1990), algunas veces se denomina SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) (Tuerk y Gold, 1990) permite la clasificación tanto para la unión como para la actividad química, pero solamente para ácidos nucleicos. Cuando la clasificación es para la unión, se incuba una mezcla de ácidos nucleicos con el sustrato inmovilizado. Los que no son aglutinantes se lavan, a continuación se liberan los aglutinantes, se amplían y se repite el proceso completo en etapas iterativas para enriquecer las secuencias que se unen mejor. Este procedimiento puede también adaptarse para permitir el aislamiento del ARN y ADN catalíticos (Green y Szostak, 1992; para estudios véase Chapman y Szostak, 1994; Joyce, 1994; Gold et al., 1995; Moore, 1995).
Sin embargo, la clasificación para la actividad "catalítica" o de unión que utiliza SELEX solamente es posible porque la misma molécula lleva a cabo la doble función de transportar la información genética y ser el catalizador o molécula de unión (aptámero). Cuando la clasificación es para "autocatálisis" la misma molécula también debe realizar la tercera función de ser un sustrato. Como el elemento genético debe desempeñar la función tanto de sustrato como de catalizador, la clasificación es solamente posible para episodios de un solo recambio. Debido a que el "catalizador" en este proceso se modifica, no es por definición un verdadero catalizador. Además, las proteínas no pueden seleccionarse utilizando el procedimiento SELEX. La gama de catalizadores, sustratos y reacciones que puede seleccionarse por consiguiente está muy limitada.
Los procedimientos anteriores que permiten rondas iterativas de mutación y clasificación son los mecanismos de simulación in vitro normalmente atribuidos al proceso de evolución: variación iterativa, clasificación progresiva para una actividad deseada y replicación. Sin embargo, ninguno de los procedimientos desarrollados hasta ahora han proporcionado moléculas de diversidad comparable y de eficacia funcional a las que se encuentran en la naturaleza. Además, no existe ningún sistema de "evolución" artificial que pueda desarrollar tanto ácidos nucleicos como proteínas para efectuar las actividades bioquímicas y biológicas completas (por ejemplo, las actividades de unión, catalítica y reguladora) y que pueda combinar varios procedimientos que conducen a un producto o actividad deseada.
Existe por lo tanto una gran necesidad de un sistema in vitro que supere las limitaciones expuestas anteriormente.
En Tawfik y Griffiths (1998), y en la solicitud de patente internacional PCT/GB98/01889, los inventores describen un sistema para la evolución in vitro que supera muchas de las limitaciones descritas anteriormente utilizando la compartimentación en microcápsulas para unir el genotipo y el fenotipo a nivel molecular.
En Tawfik y Griffiths (1998), y en varias formas de realización de la solicitud de patente internacional PCT/GB98/ 01889, la actividad deseada de un producto génico produce una modificación del elemento genético que le codifica (y está presente en la misma microcápsula). El elemento genético codificado puede seleccionarse a continuación en una etapa posterior.
En la presente memoria se describe una invención adicional en la que...
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para aislar uno o más elementos genéticos según un cambio en las propiedades ópticas de los mismos, en el que se define un elemento genético como que comprende un ácido nucleico que codifica un producto génico que presenta una actividad deseada unido a una microperla y la expresión del ácido nucleico puede resultar, directa o indirectamente, en la modificación
2. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(i), en el que el ligando está asimismo codificado por el elemento genético.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la actividad del producto génico deseado dentro de la microcápsula resulta, directa o indirectamente, en la alteración de la expresión de un segundo gen dentro del compartimento y la actividad del producto de dicho segundo gen permite el aislamiento del elemento genético utilizando un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético.
4. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(i), en el que los complejos formados uniendo los productos génicos a los elementos genéticos que los codifican se clasifican directamente sobre la base de sus propiedades ópticas cambiadas para aislar los elementos genéticos que codifican un producto génico que presenta la actividad deseada.
5. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(i), en el que los complejos formados uniendo los productos génicos a los elementos genéticos que los codifican se hacen además reaccionar para provocar un cambio condicional en las propiedades ópticas del elemento genético dependiendo de la presencia de los productos génicos con la actividad deseada en el complejo.
6. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(i), en el que los complejos formados uniendo los productos génicos a los elementos genéticos que los codifican se someten a una etapa de compartimentación adicional con el fin de aislar los elementos genéticos que codifican un producto génico que presenta la actividad deseada.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a la unión de un producto génico con propiedades ópticas características del elemento genético.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a la unión de un ligando con propiedades ópticas características por el producto génico.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a un cambio en las propiedades ópticas del producto génico cuando está unido al ligando.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a un cambio en las propiedades ópticas de un ligando cuando está unido al producto génico.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a un cambio en las propiedades ópticas tanto del ligando como del producto génico en la unión.
12. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(ii) o (iii), en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a las propiedades ópticas diferentes del sustrato y del producto de la reacción que es seleccionado.
13. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(iii), en el que tanto el sustrato como el producto presentan propiedades ópticas similares, pero únicamente el producto, y no el sustrato de la reacción que se selecciona se une o reacciona con el elemento genético, cambiando así las propiedades ópticas del elemento genético.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que los reactivos adicionales se unen específicamente a, o reaccionan específicamente con, el producto (y no el sustrato) acoplado al elemento general, alterando así las propiedades ópticas del elemento genético.
15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la actividad no deseada de un producto génico resulta en un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético que es distinto del resultante de la actividad deseada.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el cambio óptico resultante de la actividad no deseada se utiliza para seleccionar negativamente los elementos genéticos.
17. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la selección negativa se combina con la selección positiva para mejorar la especificidad de la reacción.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que la especificidad de la reacción mejorada es una mejora en la especificidad de unión.
19. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que la especificidad de la reacción mejorada es una mejora en la regio- y/o estereoselectividad para el sustrato y/o el producto.
20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los elementos genéticos se aíslan en un banco de elementos genéticos que codifica un repertorio de productos génicos.
21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cada elemento genético codifica dos o más genes y cada producto génico debe presentar una actividad deseada para que las propiedades ópticas del elemento genético se modifiquen para que les permitan clasificarse.
22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cada elemento genético codifica dos o más genes y los productos génicos deben unirse entre sí en la microcápsula para que las propiedades ópticas del elemento genético se modifiquen y los elementos genéticos se clasifiquen.
23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa adicional siguiente:
24. Procedimiento según la reivindicación 23, que comprende además repetir de manera iterativa una o más de las etapas (a) a (f).
25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la ampliación de los elementos genéticos.
26. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la microencapsulación se consigue formando una emulsión de agua en aceite de la solución acuosa en un medio a base de aceite.
27. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la microperla es amagnética, magnética o paramagnética.
28. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los elementos genéticos se clasifican mediante la detección de un cambio en su fluorescencia.
29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que la clasificación de los elementos genéticos se realiza utilizando un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS).
30. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que las propiedades de fluorescencia diferentes del sustrato y del producto se deben a la transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET).
31. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio interno de las microcápsulas está modificado por la adición de uno o más reactivos a la fase aceitosa.
32. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los elementos genéticos modificados directa o indirectamente por la actividad del producto génico deseado se modifican además mediante la Ampliación de la Señal de la Tiramida, resultando directa o indirectamente en un cambio en las propiedades ópticas de dichos elementos genéticos permitiendo así su separación.
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