Un ácido nucleico, en el que la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico:

(i) es la secuencia de nucleótidos primaria de una de la SEC DE ID Nº: 89, SEC DE ID Nº: 90, SEC DE ID Nº: 91, SEC DE ID Nº: 92, SEC DE ID Nº: 93, SEC DE ID Nº: 94, SEC DE ID Nº: 95, SEC DE ID Nº: 107, SEC DE ID Nº: 108, SEC DE ID Nº: 110, SEC DE ID Nº: 111, SEC DE ID Nº: 113, SEC DE ID Nº: 114, SEC DE ID Nº: 116, SEC DE ID Nº: 117, SEC DE ID Nº: 118, o (ii) tiene una homología superior al 80% de la secuencia primaria con una de dichas SEC DE ID Nos de (i), o (iii) tiene la secuencia de nucleótidos complementaria correspondiente a una secuencia de (i) o (ii)

Ligandos de ácido nucleico inhibidores de las ADN polimerasas.

Campo de la invención

Se describen en el presente documento procedimientos para identificar y preparar ligandos de ácido nucleico de elevada afinidad por las ADN polimerasas, específicamente, por las ADN polimerasas termoestables. La ADN polimerasa puede ser una polimerasa Taq, una polimerasa termoestable aislada de Thermus aquaticus; la polimerasa Tth, una ADN polimerasa termoestable aislada de Thermus termophilus; o la polimerasa TZ05, aislada de otra especie de Thermus. Sin embargo, se puede extender el procedimiento a la identificación y preparación de cualquier ADN polimerasa térmicamente estable. Algunas de estas ADN polimerasas termoestables tienen también la capacidad de transcribir el ARN de manera inversa para copiar ADN. Los ejemplos de ADN polimerasas con capacidad de transcripción inversa incluyen la polimerasa Tth y la TZ05. El procedimiento utilizado en el presente documento para identificar dichos ligandos de ácido nucleico se denomina SELEX, un acrónimo de Evolución Sistemática de Ligandos mediante Enriquecimiento Exponencial (por sus siglas en inglés). Se describe también en el presente documento un procedimiento mejorado para llevar a cabo de la Reacción en Cadena de la Polimerasa usando los ligandos de ácido nucleico de esta invención. Se describen específicamente en el presente documento ligandos de ácido nucleico de elevada afinidad por la polimerasa Taq, la polimerasa Tth, y la polimerasa TZ05. La invención incluye ligandos de ADN de elevada afinidad que se unen a la polimerasa TZ05, inhibiendo de esta forma su actividad polimerasa a un intervalo predeterminado de temperaturas. Se encuentran incluidos adicionalmente en esta invención los interruptores de ácidos nucleicos. La unión dependiente de la temperatura de los ligandos de ácido nucleico a las ADN polimerasas de esta invención son ejemplos de ligandos cuyas propiedades deseables se pueden activar o desactivar basándose en cualquier número de condiciones de reacción, tales como el pH y la concentración salina.

Antecedentes de la invención

La Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es una técnica recientemente desarrollada que ha tenido un impacto significativo en muchas áreas de la ciencia. La PCR es un procedimiento rápido y sencillo para amplificar específicamente una secuencia de ADN diana de una manera exponencial. (Saiki y col. (1985) Science 230:1350; Mullis y Faloona (1987) Methods Enzymol. 155:335). De manera breve, el procedimiento consisten en sintetizar un conjunto de cebadores que tengan secuencias de nucleótidos complementarias del ADN que flanquea la secuencia diana. A continuación, se mezclan los cebadores con una disolución de un ADN diana, una ADN polimerasa termoestable y los cuatro trifosfatos de desoxinucleótido (dATP, dTTP, dCTP y dGTP). A continuación, la disolución se calienta a una temperatura suficiente para separar las cadenas complementarias del ADN (aproximadamente 95ºC) y a continuación se enfría a una temperatura suficiente para permitir que los cebadores se unan a las secuencias flanqueantes. A continuación se calienta la mezcla de reacción de nuevo (a aproximadamente 72ºC) para dejar que proceda la síntesis de ADN Tras un corto periodo de tiempo, temperatura de la mezcla de reacción se incrementa de nuevo hasta una temperatura suficiente para separar el ADN bicatenario recientemente formado, completando de esta manera el primer ciclo de la PCR. A continuación la mezcla de reacción se enfría y se repite el ciclo. De esta manera, la PCR está constituida por ciclos repetitivos de fusión, hibridación y síntesis de ADN. Veinte ciclos de replicación pueden dar como resultado una amplificación de hasta un millón de veces la secuencia de ADN diana. La capacidad de amplificar una molécula de ADN sencilla mediante la PCR tiene aplicaciones en microbiología ambiental y alimentaria (Wemars y col. (1991) Appl. Env. Microbiol. 57: 1914-1919; Hill y Keasler (1991) Int. J. Food Microbiol. 12: 67-75), microbiología clínica (Wages y col. (1991) J. Med. Virol. 33: 58-63; Sacramento y col. (1991) Mol. Cell Probes 5: 229-240; Laure y col. (1988) Lancet 2:538), oncología (Kumar y Barbacid (1988) Oncogene 3: 647-651; McCormick (1989) Cancer Cells 1: 56-61; Crescenzi y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4869), pronóstico de enfermedades genéticas (Handyside y col. (1990) Nature 344: 768-770), bancos de sangre (Jackson (1990) Transfusion 30: 51-57) y forenses (Higuchi y col. (1988) Nature (Londres) 332:543).

La disponibilidad de ADN polimerasas termoestables tales como la ADN polimerasa Taq ha simplificado y mejorado la PCR. Originalmente, solo las polimerasas sensibles al calor, tales como la ADN polimerasa de E. coli, estaban disponibles para uso en la PCR. Sin embargo, las polimerasas sensibles al calor se destruyen a las temperaturas requeridas para fundir el ADN bicatenario y debe agregarse polimerasa adicional después de cada ciclo de la PCR. La ADN polimerasa Taq, aislada de la bacteria termofílica Thermus aquaticus, es estable hasta los 95ºC y su uso en la PCR ha eliminado la necesidad de repetidas adiciones de polimerasas sensibles a la temperatura después de cada ciclo térmico. Adicionalmente, debido a que se puede usar la polimerasa Taq a temperaturas más elevadas, se ha mejorado la especificidad y la sensibilidad de la PCR. La razón de la mejora en la especificidad es que a temperaturas más elevadas la unión de los cebadores a sitios diferentes de los deseados (denominado como cebado incorrecto) se reduce significativamente.

Desde su descubrimiento, la Reacción en Cadena de la Polimerasa se ha modificado para diversas aplicaciones, tales como la PCR in situ, en la que se ha empujado el límite de detección de la hibridación in situ tradicional hasta el nivel de la copia individual (Haase y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4971-4975), y la PCR mediante la transcriptasa inversa (RT-PCR) en la que una secuencia de ARN se convierte en su copia de ADN (ADNc) antes de amplificarse mediante la PCR, convirtiendo el ARN en un sustrato de la PCR (Kawasaki (1991) Amplification of RNA in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis y col., Eds. Academic Press Inc., San Diego, CA, 21-27). Las transcriptasas inversas víricas mesófilas, sin embargo, son a menudo incapaces de sintetizar moléculas de ADNc de longitud completa debido a que no pueden "leer a través de" las estructuras secundarias estables de las moléculas de ARN. Esta limitación se ha superado recientemente mediante el uso de una polimerasa aislada de Thermus termophilus (polimerasa Tth). La polimerasa Tth es una polimerasa termoestable que puede funcionar a la vez como transcriptasa inversa y ADN polimerasa (Myers y Gelfand (1991) Biochemistry 30: 7661-7666). La transcripción inversa llevada a cabo a una temperatura elevada mediante la polimerasa Tth elimina las estructuras secundarias de la plantilla de ARN haciendo posible la síntesis del ADNc de longitud completa.

Aunque se ha realizado un progreso significativo en la tecnología de la PCR, la amplificación de oligonucleótidos no dirigidos debida a reacciones secundarias, tales como el cebado incorrecto del ADN de base y/o la oligomerización de los cebadores sigue presentando un problema significativo. Esto es especialmente verdadero en aplicaciones diagnósticas en las que se lleva a cabo la PCR en un medio que contiene ADN de base mientras que el ADN diana puede estar presente en una copia individual (Chou y col. (1992) Nucleic Acid Res. 20: 1717-1723). Se ha atribuido la generación de productos amplificados no específicamente a la actividad de la polimerasa a temperatura ambiente que se extiende a cebadores hibridados inespecíficamente (Chou y col. (1992) Nucleic Acid Res. 20: 1717-1723, Li y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4580). Según esto, la inhibición de la actividad de la polimerasa a temperatura ambiente es importante para controlar la generación de productos inespecíficos.

Se ha informado de dos procedimientos que minimizan estas reacciones secundarias. En el primer procedimiento, denominado PCR "con arranque en caliente manual", un componente crítico para la actividad de la polimerasa (por ejemplo, iones divalentes y/o la propia polimerasa) no se añade a la mezcla de reacción hasta que la temperatura de la mezcla es lo suficientemente elevada para evitar la hibridación inespecífica del cebador. (Chou y col. (1992) Nucleic Acid Res. 20: 1717-1723; D'Aquila y col....

1. Un ácido nucleico, en el que la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico:

(i) es la secuencia de nucleótidos primaria de una de la SEC DE ID Nº: 89, SEC DE ID Nº: 90, SEC DE ID Nº: 91, SEC DE ID Nº: 92, SEC DE ID Nº: 93, SEC DE ID Nº: 94, SEC DE ID Nº: 95, SEC DE ID Nº: 107, SEC DE ID Nº: 108, SEC DE ID Nº: 110, SEC DE ID Nº: 111, SEC DE ID Nº: 113, SEC DE ID Nº: 114, SEC DE ID Nº: 116, SEC DE ID Nº: 117, SEC DE ID Nº: 118, o

(ii) tiene una homología superior al 80% de la secuencia primaria con una de dichas SEC DE ID N^os de (i), o

(iii) tiene la secuencia de nucleótidos complementaria correspondiente a una secuencia de (i) o (ii).

2. Un ácido nucleico según la reivindicación 1 en el que el ácido nucleico es uno de la SEC DE ID Nº: 89, SEC DE ID Nº: 90, SEC DE ID Nº: 91, SEC DE ID Nº: 92, SEC DE ID Nº: 93, SEC DE ID Nº: 94, SEC DE ID Nº: 95, SEC DE ID Nº: 107, SEC DE ID Nº: 108, SEC DE ID Nº: 110, SEC DE ID Nº: 111, SEC DE ID Nº: 113, SEC DE ID Nº: 114, SEC DE ID Nº: 116, SEC DE ID Nº: 117, SEC DE ID Nº: 118.

3. Un ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2 en el que el ácido nucleico es un ligando de ácido nucleico de elevada afinidad por una ADN polimerasa.

4. El ligando de ácido nucleico según la reivindicación 3 en el que el ligando de ácido nucleico presenta una unión dependiente de la temperatura con una ADN polimerasa.

5. El ligando de ácido nucleico según la reivindicación 3 ó 4 en el que el ligando de ácido nucleico es un inhibidor de la capacidad de la ADN polimerasa para catalizar la síntesis de ADN.

6. Un ligando de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en el que la ADN polimerasa es la polimerasa TZ05.

7. Un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que el ácido nucleico se purifica y aísla.

8. Un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que el ácido nucleico es un ADN monocatenario.

9. Uso de un ácido nucleico según la parte (i) o (ii) de la reivindicación 1 o una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8 como dependientes de la parte (i) o (ii) de la reivindicación 1 en una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

10. Un kit para la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) que comprende una ADN polimerasa termoestable y un ligando de ácido nucleico que inhibe dicha polimerasa a temperatura ambiente, permitiendo adicionalmente que se produzca la síntesis durante los ciclos del procedimiento de la PCR a elevada temperatura, en el que la secuencia de nucleótidos del ligando de ácido nucleico

(i) es la secuencia de nucleótidos primaria de una de la SEC DE ID Nº: 89, SEC DE ID Nº: 90, SEC DE ID Nº: 91, SEC DE ID Nº: 92, SEC DE ID Nº: 93, SEC DE ID Nº: 94, SEC DE ID Nº: 95, SEC DE ID Nº: 107, SEC DE ID Nº: 108, SEC DE ID Nº: 110, SEC DE ID Nº: 111, SEC DE ID Nº: 113, SEC DE ID Nº: 114, SEC DE ID Nº: 116, SEC DE ID Nº: 117, SEC DE ID Nº: 118, o

(ii) tiene una homología superior al 80% de la secuencia primaria con una de dichas SEC DE ID N^os de (i).

11. Un kit para PCR según la reivindicación 10 en el que la ADN polimerasa es la polimerasa TZ05.

12. Un procedimiento para llevar a cabo la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) que comprende:

a) mezclar una muestra que contiene una secuencia de ácido nucleico que se va a amplificar, con cebadores que son complementarios de las secuencias que flanquean la secuencia que se va a amplificar, una polimerasa termoestable, y un ligando de ácido nucleico que es capaz de inhibir la polimerasa a 55ºC, permitiendo además que se active la polimerasa a temperaturas por encima de 55ºC: y

b) llevar a cabo las etapas de la PCR estándar de fusión del ácido nucleico, hibridación de los cebadores con el ácido nucleico diana, y síntesis del ácido nucleico, mediante ciclación térmica de la mezcla,

en el que la secuencia de nucleótidos del ligando de ácido nucleico:

(i) es la secuencia de nucleótidos primaria de una de la SEC DE ID Nº: 89, SEC DE ID Nº: 90, SEC DE ID Nº: 91, SEC DE ID Nº: 92, SEC DE ID Nº: 93, SEC DE ID Nº: 94, SEC DE ID Nº: 95, SEC DE ID Nº: 107, SEC DE ID Nº: 108, SEC DE ID Nº: 110, SEC DE ID Nº: 111, SEC DE ID Nº: 113, SEC DE ID Nº: 114, SEC DE ID Nº: 116, SEC DE ID Nº: 117, SEC DE ID Nº: 118, o

(ii) tiene una homología superior al 80% de la secuencia primaria con una de dichas SEC DE ID N^os de (i).

13. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que dicha polimerasa termoestable es la polimerasa TZ05.