Sustrato de diubiquitina marcada con fluorescencia para un ensayo de desubiquitinasas.

Un sustrato para medir la actividad de una enzima desubiquitinante (DUB),

que comprende una molécula de diubiquitina, en donde la ubiquitina C-terminal de la molécula de diubiquitina se marca con un marcador fluorescente, y en donde la Gly76 de dicha diubiquitina C-terminal se sustituye con una secuencia para incorporar el marcador fluorescente.

Sustrato de diubiquitina marcada con fluorescencia para un ensayo de desubiquitinasas

La presente Invención se refiere a un ensayo para la actividad de desubiquitinasas (DUB). En particular, la invención se refiere a un ensayo que usa un sustrato natural para la actividad DUB, que comprende una construcción de diubiquitina marcada que se escinde por la enzima DUB. La invención se refiere también a métodos para preparar tales construcciones, y técnicas que hacen uso del ensayo.

La ubiquitinación de proteínas es una modificación postraduccional versátil con funciones en la degradación proteica, señalización celular, tráfico ¡ntracelular y respuesta al daño del ADN (Chen and Sun, Mol Cell 33 (3), 275- 286, 29; Komander, Biochem Soc Trans 37 (Pt 5), 937-953, 29). Los polímeros de ubiquitina están unidos a través de uno de siete residuos internos de Usina (K) o a través del grupo amino N-terminal. Es importante que el tipo de enlace de la ubiquitina determina el resultado funcional de la modificación (Komander, 29). Los polímeros de ubiquitina mejor estudiados, cadenas enlazadas a través de K48 y K63, tienen funciones degradativas y no degradatlvas respectivamente (Chen and Sun, 29; Hershko and Ciechanover, Annu Rev Biochem 67, 425-479, 1998). Sin embargo, datos recientes han revelado una gran abundancia inesperada de las llamadas cadenas atípicas de ubiquitina; por ejemplo, se ha descubierto que los enlaces-K11 son tan abundantes como los enlaces- K48 en S. cerevisiae (Peng et al., Nat Biotechnol 21 (8), 921-926, 23; Xu et al., Cell 137 (1), 133-145, 29).

Las cadenas de poli(ubiquitina) se ensamblan sobre sustratos a través de la acción concertada de una cascada enzimática de tres pasos, que implica una enzima E1 activadora de ubiquitina, una enzima E2 de conjugación de ubiquitina, y ligasas E3 de ubiquitina. Aunque las ligasas E3 fijan las cadenas de poli(ubiquitina) en una diana y por tanto confieren especificidad de sustrato, se cree que las enzimas E2 determinan el tipo de enlace catenario en las cadenas de poli(ubiquitina). Se han identificado enzimas E2 específicas de K48 y K63 (Chen and Pickart, J Biol Chem 265, 21835-42, 199; Hofmann and Pickart, Cell 96, 645-53, 1999), lo que ha permitido el análisis estructural de estos tipos de cadenas así como un conocimiento detallado de la especificidad de dominios de unión a ubiquitina y de desubiquitinasas (DUBs) (revisado en Komander, 29). Se han diseñado enzimas específicas de K11, y se describen en nuestra solicitud de patente de UK , en tramitación con la presente, 1774.8; ver también Bremm et al., Nature Struct Mol Biol. 21, Aug 17(8), 939-47. Además, polímeros de ubiquitina lineales enlazados por extremos N-terminales se pueden sintetizar enzimáticamente a través del complejo LUBAC (Kirisako et al, EMBO J 25(2):4877-87, 26), o por técnicas de biología molecular.

Se conocen en la técnica ensayos para la actividad DUB, que pueden seguir la actividad DUB in vitro. Estos ensayos se compendian en Shanmugham and Ovaa, Curr. Opin. Drug Disc. Dev. (28) 11(5), 688-696. El ensayo usado más comúnmente se basa en el sustrato sintético ubiquitin-7-amido-4-metilcumarina (Ub-AMC), que es aceptado por una variedad de enzimas DUB. Sin embargo, en común con otros sustratos sintéticos conocidos, Ub-AMC comprende una sola molécula de ubiquitina que ha sido marcada; el marcador se libera tras la escisión por DUB. Por tanto, la escisión no es de un enlace isopeptídico entre dos restos de ubiquitina como ocurre en un sustrato natural. La molécula de AMC liberada es fluorescente, y su velocidad de liberación se puede medir y relacionar con la actividad DUB (Dang et al, Biochemistry Feb 17;37(7):1868-79, 1998).

El documento US2729297 describe composiciones y métodos para regular proteasas de procesamiento específicas de ubiquitina usando sustratos de poli(ubiquitina) marcados con fluorescencia.

Por tanto sigue habiendo en la técnica una necesidad de un ensayo de enzimas DUB, que mida la escisión de un enlace de ubiquitina natural. Convenientemente, un ensayo de este tipo permitiría el uso de dímeros de ubiquitina con enlaces particulares, para reflejar mejor la especificidad de unión en enzimas DUB.

Compendio de la invención

Hemos descubierto que un ensayo para la actividad de enzimas DUB se puede basar en un sustrato que comprende una molécula de diubiquitina marcada con fluorescencia, en donde la escisión de la molécula de diubiquitina se puede seguir por anisotropía de fluorescencia, denominada también polarización de fluorescencia, o por transferencia de energía de resonancia de Fórster (FRET). Por tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un sustrato para medir la actividad de una enzima desubiquitinante (DUB), como se define en la reivindicación 1.

La anisotropía de fluorescencia mide el volteo de una molécula fluorescente en disolución, y la velocidad de volteo depende del tamaño (peso molecular) y forma de la molécula. Tras la excitación de un fluoróforo con luz polarizada, el grado de polarización de la luz emitida polarizada está relacionado con la velocidad de volteo de la molécula fluorescente. Si la molécula cambia de tamaño, como cuando una molécula de diubiquitina se escinde por DUB, cambiará la velocidad de volteo; una reducción del tamaño de la molécula por escisión cambiará la velocidad de volteo, y cambiará el grado de polarización de la luz emitida, que se puede medir fácilmente.

El sustrato es una molécula de diubiquitina marcada, como se define en las reivindicaciones. Aunque se prefieren dímeros de ubiquitina, se pueden usar polímeros más largos de ubiquitina, especialmente en relación con enzimas DUB que no escinden dímeros eficazmente. Si se usan polímeros más largos, el marcador se encuentra

preferiblemente en un monómero de ubiquitina terminal; sin embargo, el fluoróforo puede estar situado en cualquier monómero de la molécula de poli(ubiquitina).

Convenientemente se marca el monómero de ubiquitina C-terminal.

En una realización adicional, se puede marcar más de un monómero de ubiquitina. Por ejemplo, se pueden marcar dos monómeros usando diferentes colorantes, y se puede monltorizar la emisión FRET resultante. La señal FRET es dependiente de la proximidad de los colorantes, y cambiará si los monómeros se trasladan conjuntamente más cercanos o más separados.

El marcador puede ser cualquier marcador fluorescente. Normalmente los marcadores fluorescentes comprenden un fluoróforo, tal como isotiocianato derivados aminorreactivos, como FITC y TRUC (derivados de fluoresceína y rodamina), succinimidil-ésteres aminorreactivos tales como NHS-fluoresceína, fluoróforos activados por maleimida reactivos de grupos sulfhidrilo, tales como fluorescein-5-maleimida, y fluoróforos disponibles comercialmente tales como los colorantes Alexa (Invitrogen).

Tales compuestos se pueden usar para marcar una molécula de ubiquitina, opcionalmente mediante la unión a través de una etiqueta polipeptfdica unida a la propia ubiquitina. Por ejemplo, las etiquetas que contienen uno o más residuos de cisterna se pueden marcar de varias maneras. Se conocen en la técnica marcadores fluorescentes blarsenlcales, y son útiles en la presente Invención. Convenientemente se utiliza el sistema de marcado fluorescente con etiqueta FIAsH, disponible de Invitrogen. El péptldo (X)CCXXCC sustituye a los aminoácidos C-terminales de la ubiquitina a marcar, y se usó el reactivo Lumlo Green (Invitrogen) para marcar la molécula a través de la interacción con los cuatro residuos de cisterna. Por ejemplo, se puede usar el péptido WCCPGCC.

Los 5 últimos aminoácidos (R72LRGG76) del extremo C-termlnal de la ubiquitina se sustituyen con la secuencia anterior, WCCPGCC. Se sustituye Gly76 de la cola C-termlnal de la Ub con el fin de evitar que las DUBs escindan la etiqueta fluorescente de la molécula de ubiquitina. Es admisible una supresión más corta del extremo C-terminal de la ubiquitina siempre y cuando se elimine la Gly76. Tal sustitución C-terminal se puede hacer solamente en la ubiquitina proxlmal. Sin embargo, ambas ubiquitinas distal y proximal se pueden marcar en sus extremos N- termlnales.

La adición de un residuo de Trp en la etiqueta FIAsH tiene ventajas adicionales que permiten la cuantificación más exacta de la diubiquitlna midiendo la absorbancia a 28 nm. La ubiquitina no contiene residuos de Trp y por tanto es un reto medir su concentración con exactitud. Sin embargo, para medidas cinéticas se necesita determinar con exactitud las concentraciones de sustrato y la adición de un residuo de Trp permite esto.

Una etiqueta puede comprender también un solo residuo de Cys para marcar con fluoróforos Alexa.... [Seguir leyendo]

1. Un sustrato para medir la actividad de una enzima desubiquitinante (DUB), que comprende una molécula de diubiquitina, en donde la ubiquitina C-terminal de la molécula de dlublqultlna se marca con un marcador fluorescente, y en donde la Gly76 de dicha diubiquitina C-term¡nal se sustituye con una secuencia para incorporar el marcador fluorescente.

2. Un sustrato según la reivindicación 1, en donde un residuo de Trp se incorpora con el marcador fluorescente para permitir la cuantificación exacta.

3. Un sustrato según cualquier reivindicación precedente, que comprende tres o más monómeros de ubiquitina.

4. Un sustrato según cualquier reivindicación precedente, en donde el marcador fluorescente es un reactivo fluorescente biarsenical, preferiblemente en donde el reactivo biarsenical es EDT2[4',5l-bis(1,3,2-ditioarsolan-2-il) fluoresce¡n-(1,2-etanod¡t¡ol)2].

5. Un sustrato según cualquier reivindicación precedente, en donde al menos dos monómeros de ubiquitina se marcan con diferentes marcadores fluorescentes y en donde los diferentes marcadores fluorescentes constituyen opcionalmente un par para FRET.

6. Un sustrato según cualquier reivindicación precedente, en donde cada enlace entre los monómeros de ubiquitina comprende un enlace entre un residuo de lisina en la misma posición y el extremo C-terminal de un monómero adyacente.

7. Un sustrato según la reivindicación 6, en donde el residuo de lisina se selecciona del grupo que consiste en K6, K11, K27, K29, K33, K48 y K63, preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en K63, K48 y K11.

8. Un sustrato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde los monómeros de ubiquitina son lineales, enlazados a través de Met 1.

9. Un método para ensayar la actividad de una enzima desubiquitinante (DUB) que comprende exponer un sustrato, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, a una DUB y monitorizar la escisión del sustrato mediante anisotropla de fluorescencia o FRET.

1. Un método según la reivindicación 9, en donde se ensaya la cinética enzimática de la DUB.

11. Un método para ensayar la actividad de unión de un UBD, que comprende exponer un sustrato, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, a un UBD que es una DUB inactiva o un UBD que no escinde un sustrato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y monitorizar la unión del sustrato al UBD mediante anisotropla de fluorescencia o FRET.

12. Un método para ensayar uno o más candidatos inhibidores de la actividad DUB, que comprende las etapas de:

(a) ensayar una DUB según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para establecer una actividad de referencia para la DUB;

(b) ensayar una DUB según la etapa (a) en presencia de uno o más candidatos inhibidores de la DUB, y monitorizar los cambios en la actividad.

13. Un método según la reivindicación 12, en donde la actividad se selecciona de una actividad de unión y una actividad de escisión.

14. Un método según la reivindicación 12, en el que la etapa (b) se lleva a cabo en un formato de ensayo múltiple.