ESTA INVENCION DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR UN COMPLEJO TERAPEUTICO O DE DIAGNOSTICO FORMADO POR UN LIGANDO DE ACIDO NUCLEICO Y UN COMPUESTO LIPOFILO O UN COMPUESTO DE ELEVADO PESO MOLECULAR NO INMUNOGENICO,

MEDIANTE LA IDENTIFICACION DE UN LIGANDO DE ACIDO NUCLEICO POR LA METODOLOGIA SELEX Y LA ASOCIACION DEL LIGANDO DE ACIDO NUCLEICO CON UN COMPUESTO LIPOFILO O UN COMPUESTO DE ELEVADO PESO MOLECULAR NO INMUNOGENICO. LA INVENCION ADEMAS DESCRIBE COMPLEJOS FORMADOS POR UNO O MAS LIGANDOS DE ACIDO NUCLEICO ASOCIADOS CON UN COMPUESTO LIPOFILO O CON UN COMPUESTO DE ELEVADO PESO MOLECULAR NO INMUNOGENICO

Complejos de ligandos de ácido nucleico.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para preparar un complejo terapéutico o de diagnóstico comprendido de un ligando de ácido nucleico y un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado mediante la identificación de un ligando de ácido nucleico mediante metodología SELEX y la asociación del ligando de ácido nucleico con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado. La presente invención también se refiere a la mejora de las propiedades farmacocinéticas de un ligando de ácido nucleico mediante la asociación del ligando de ácido nucleico a un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado para formar un complejo. La presente invención también incluye complejos que comprenden un ligando de ácido nucleico asociado con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado.

Antecedentes de la invención

A. SELEX

El dogma durante muchos años fue que los ácidos nucleicos tenían principalmente un papel informativo. A través del método conocido como Evolución Sistemática de Ligandos mediante enriquecimiento Exponencial, denominado, SELEX, se ha visto claramente que los ácidos nucleicos presentan una diversidad estructural tridimensional similar a las proteínas. SELEX es un método para la evolución in vitro de moléculas de ácido nucleico con una unión altamente específica a moléculas diana y se describe en la Solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de Serie 07/536,428, solicitada el 11 de junio de 1990, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment", ya abandonada. La solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de Serie. 07/714,131, solicitada el 10 de junio de 1991, titulada "Nucleic Acid Ligands", ahora la Patente de Estados Unidos No. 5,475,096, la solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de Serie. 07/931,473, solicitada el 17 de agosto de 1992, titulada "Nucleic Acid Ligands", ahora la Patente de Estados Unidos No. 5,270,163 (véase también PCT/US91/04078). Cada una de estas solicitudes, referidas en general en la presente invención como las Solicitudes de Patentes de SELEX, describe un método fundamentalmente nuevo para producir un ligando de ácido nucleico para cualquier molécula diana deseada. El proceso SELEX proporciona un tipo de productos a los que se hace referencia como ligandos de ácido nucleico, teniendo cada ligando una única secuencia, y que tiene la propiedad de unirse específicamente a un compuesto o molécula dianas deseados. Cada ligando de ácido nucleico identificado por SELEX es un ligando específico de un compuesto o molécula dianas determinados. SELEX se basa en la visión única de que los ácidos nucleicos tienen capacidad suficiente para formar una variedad de estructuras bidimensionales y tridimensionales y suficiente versatilidad química disponible en sus monómeros para actuar como ligandos (forman parejas de unión específica) con prácticamente cualquier compuesto químico, tanto monomérico como polimérico. Las moléculas de cualquier tamaño o composición pueden utilizarse como dianas.

El método SELEX implica la selección entre una mezcla de oligonucleótidos candidatos e iteraciones por etapas de la unión, separación y amplificación, utilizando el mismo esquema de selección general, para conseguir prácticamente cualquier criterio deseado de afinidad y selectividad de unión. Partiendo de una mezcla de ácidos nucleicos, que comprenden preferiblemente un segmento de secuencia aleatoria, el método SELEX incluye las etapas de poner en contacto la mezcla con la diana en las condiciones favorables para la unión, separar los ácidos nucleicos no unidos de los ácidos nucleicos que se han unido específicamente a moléculas diana, disociar los complejos ácido nucleico-diana, amplificar los ácidos nucleicos disociados de los complejos ácido nucleico-diana para obtener una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en ligandos, y a continuación, repetir las etapas de unión, separación, disociación y amplificación durante tantos ciclos como se desee para obtener ligandos de ácidos nucleicos de afinidad elevada altamente específicos con la molécula diana.

Los presentes inventores reconocen que el método SELEX demuestra que los ácidos nucleicos como compuestos químicos pueden formar un amplio espectro de formas, tamaños y configuraciones, y son capaces de un repertorio mucho más amplio de unión y otras funciones que los mostrados por los ácidos nucleicos en los sistemas biológicos.

Los presentes inventores reconocen que los procesos SELEX o de tipo SELEX se podrían utilizar para identificar ácidos nucleicos que pueden facilitar cualquier reacción elegida de manera similar a aquella en la que los ligandos de ácidos nucleicos se pueden identificar para cualquier diana. En teoría, en la mezcla de candidatos de aproximadamente 1013 a 1018 ácidos nucleicos, los presentes inventores postulan que por lo menos existe un ácido nucleico con la forma apropiada para facilitar cada una de una amplia variedad de interacciones físicas y químicas.

El método SELEX básico se ha modificado para conseguir una serie de objetivos específicos. Por ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 07/960,093, solicitada el 14 de octubre de 1992, titulada "Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure." describe el uso de SELEX conjuntamente con electroforesis en gel para seleccionar moléculas de ácido nucleico con características estructurales específicas, tales como ADN curvado. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/123,935, solicitada el 17 de septiembre de 1993, titulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands", describe un método basado en SELEX para la selección de ligandos de ácidos nucleicos que contienen grupos fotoreactivos capaces de unirse y/o fotoreticularse y/o fotoinactivar una molécula diana. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/134,028, solicitada el 7 de octubre de 1993, titulada "High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine", describe un método para identificar ligandos de ácido nucleico altamente específicos capaces de discriminar entre moléculas estrechamente relacionadas, que pueden ser no peptídicas, denominado Contra-SELEX. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie No. 08/143,564, solicitada el 25 de octubre de 1993, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX", describe un método basado en SELEX que consigue una separación altamente eficaz entre oligonucleótidos que tienen una afinidad elevada y baja por una molécula diana.

El método SELEX comprende la identificación de ligandos de ácidos nucleicos de afinidad elevada que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas al ligando, tal como una estabilidad in vivo mejorada o características de liberación mejoradas. Entre los ejemplos de dichas modificaciones se incluyen sustituciones químicas en la ribosa y/o fosfato y/o posiciones de las bases. Los ligandos de ácidos nucleicos identificados por SELEX que contienen nucleótidos modificados se describen en la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/117,991, solicitada el 8 de septiembre de 1993, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", que describe oligonucleótidos que contienen derivados de nucleótidos modificados químicamente en las posiciones 5 y 2' de las pirimidinas. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/134,028, supra, describe ligandos de ácidos nucleicos altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2'-amino (2'-NH₂), 2'-fluoro (2'-F), y/o 2'-O-metilo (2'-OMe). La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/264,029, solicitada el 22 de junio de 1994, titulada "Novel Method of Preparation of 2' Modified Pyrimidine Intramolecular Nucleophilic Displacement", describe oligonucleótidos que contienen diversas pirimidinas modificadas en 2'.

El método SELEX comprende combinar oligonucleótidos seleccionados con otros oligonucleótidos seleccionados y unidades funcionales que no son oligonucleótidos tal como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/284,063, solicitada el 2 de agosto de 1994, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX" y la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/234,997, solicitada el 28 de abril de 1994, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX", respectivamente. Estas solicitudes permiten la...

1. Método para la preparación de un complejo terapéutico o de diagnóstico que comprende un ligando de ácido nucleico de cadena sencilla y un polietilenglicol unido covalentemente en los extremos 5' ó 3' del ligando de ácido nucleico, en el que el ligando de ácido nucleico tiene una afinidad y especificidad elevada por una molécula diana diferente de un polinucleótido que se une al ligando de ácido nucleico a través de un mecanismo que depende del emparejamiento de bases de Watson/Crick o la unión en triple hélice y en el que el polietilenglicol tiene un peso molecular de 1000 Da o más, comprendiendo dicho método la unión covalente de un ligando de ácido nucleico de cadena sencilla a polietilenglicol que tiene un peso molecular de 1000 Da o más en los extremos 5' ó 3' del ligando de ácido nucleico, en el que el método comprende identificar el ligando de ácido nucleico a partir de una mezcla candidata de ácidos nucleicos mediante un método que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una mezcla candidata de ácidos nucleicos de cadena sencilla con la molécula diana en condiciones favorables para la unión;

(b) separar los ácidos nucleicos no unidos de los ácidos nucleicos que se han unido a moléculas diana;

(c) disociar las parejas ácido nucleico-diana;

(d) amplificar los ácidos nucleicos disociados de las parejas ácido nucleico-diana para obtener una mezcla enriquecida en ligando de ácidos nucleicos;

en el que las etapas (a)-(d) se repiten mediante tantos ciclos como se deseen para obtener un ligando de ácido nucleico para la molécula diana.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el método comprende unir covalentemente el polietilenglicol con el grupo hidroxilo en 5' ó 3' del ligando de ácido nucleico.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el método comprende unir covalentemente el polietilenglicol con 5' tiol a través de una funcionalidad maleimida o vinil sulfona.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el método comprende unir covalentemente una molécula enlazadora a los extremos 5' ó 3' del ligando de ácido nucleico y unir covalentemente la molécula enlazadora al polietilenglicol.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el ligando de ácido nucleico tiene una unión fosfodiéster invertida 3'3' en el extremo 3'.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ligando de ácido nucleico es ADN.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ligando de ácido nucleico es ARN.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ligando de ácido nucleico está químicamente modificado.

9. Método según la reivindicación 8, en el que la modificación se elige del grupo: