Procedimiento para preparar un producto génico que presenta una actividad deseada,

comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

a) expresión in vitro de un ácido nucleico que codifica dicho producto génico ligado funcionalmente a las secuencias de control que dirigen la hipermutación en una población de células linfoides, en el que dicha población clónica de células linfoides pueden alterar una o más secciones específicas del ácido nucleico sin el requisito para la estimulación externa;

b) identificar una célula o células en el interior de dicha población clonal de células linfoides que expresa un producto génico mutado que presenta la actividad deseada; y

c) determinar una o más poblaciones clonales de células a partir de la célula o células identificadas en la etapa (b) y seleccionar a partir de dichas una o más poblaciones clonales una población de célula o células que expresan un producto génico que presenta una actividad deseada mejorada;

en el que las etapas (b) y (c) se repiten de manera iterativa

Procedimiento para la generación de diversidad.

La presente invención se refiere a un procedimiento para generar diversidad en un gen o producto génico aprovechando la capacidad de hipermutación somática natural de las células productoras de anticuerpos, así como a las estirpes celulares que pueden generar diversidad en productos génicos definidos.

Muchos enfoques in vitro para la generación de diversidad en productos génicos se basan en la generación de un número muy grande de mutantes que se seleccionan a continuación utilizando potentes tecnologías de selección. Por ejemplo, la tecnología de exposición en fagos ha tenido mucho éxito proporcionando un vehículo que permite la selección de una proteína expuesta (Smith, 1985; Bass et al., 1990; McCafferty et al., 1990; para estudios véase Clackson y Wells, 1994). Asimismo, se han seleccionado ligandos peptídicos específicos para la unión a receptores por selección de afinidad utilizando grandes bancos de péptidos unidos al terminal C del represor Lacl de lac (Cull et al., 1992). Cuando se expresa en E. coli la proteína represora une físicamente el ligando al plásmido codificador mediante la fijación a una secuencia del operador lac en el plásmido. Además, se ha descrito también un sistema de exposición en el polisoma completamente in vitro (Mattheakis et al., 1994) en el que los péptidos nacientes están unidos físicamente mediante el ribosoma al ARN que les codifica.

El repertorio primario de especificidades de anticuerpos se crea in vivo mediante un proceso de cambio de posición del ADN que implica la unión de segmentos de los genes V, D y J de inmunoglobulina. Después del encuentro del antígeno en el ratón y el hombre, los genes V cambiados de posición en estos linfocitos B que han sido activados por el antígeno se someten a una segunda onda de diversificación, esta vez por hipermutación somática. Esta hipermutación genera el repertorio secundario a partir del que las buenas especificidades de unión pueden seleccionarse permitiendo así la maduración por afinidad de la respuesta inmunitaria humoral.

Los sistemas de selección artificial hasta la fecha se basan mucho en la mutación inicial y en la selección, similar en concepto a la fase inicial del cambio de posición V-D-J que aparece en la producción del anticuerpo natural, porque proporciona la generación de un repertorio "fijo" de mutantes de producto génico a partir del cual pueden seleccionarse los productos génicos que tienen la actividad deseada.

La selección y evolución del ARN in vitro (Ellington y Szostak, 1990), denominada a veces SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) (Tuerk y Gold, 1990) permite la selección tanto de la actividad de unión como química, pero solamente para los ácidos nucleicos. Cuando la selección es para la unión, una mezcla de ácidos nucleicos se incuba con el sustrato inmovilizado. Los no aglutinantes se lavan fuera, a continuación se liberan los aglutinantes, se amplían y el proceso en su conjunto se repite en etapas iterativas para enriquecer las secuencias que se unen mejor. Este procedimiento puede también adaptarse para que permita el aislamiento de ARN y ADN catalíticos (Green y Szostak, 1992; para estudios véase Chapman y Szostak, 1994; Joyce, 1994; Gold et al., 1995; Moore, 1995). SELEX, por lo tanto, permite etapas cíclicas de mejoramiento de la actividad deseada, pero está limitada en su alcance a la preparación de ácidos nucleicos.

A diferencia en el sistema inmunitario natural, sin embargo, los sistemas de selección artificial son poco adecuados a cualquier forma fácil de "maduración por afinidad" o para las etapas cíclicas de la generación y desarrollo del repertorio. Una de las razones para esto es que es difícil dirigir las mutaciones a las regiones de la molécula donde son necesarias, tanto los ciclos posteriores de mutación como la selección no conducen al aislamiento de las moléculas con actividad mejorada con eficacia suficiente.

Mucho de lo que se conoce acerca del proceso de hipermutación somática que acontece durante la maduración por afinidad en la producción del anticuerpo natural procede de un análisis de las mutaciones que han sucedido durante la hipermutación in vivo (para estudios véase Neuberger y Milstein, 1995; Weill y Raynaud, 1996; Parham, 1998). La mayoría de estas mutaciones son sustituciones nucleotídicas individuales que se introducen paso a paso. Ellas se dispersan en un dominio V cambiado de posición, aunque estos puntos conflictivos característicos, y las sustituciones presentan un sesgo para las transiciones básicas. Las mutaciones se acumulan en gran medida durante la expansión de linfocitos B en los centros germinativos (en lugar de durante otras etapas de la diferenciación y proliferación de linfocitos B) con la velocidad de incorporación de sustituciones nucleotídicas en el gen V durante la fase de hipermutación estimada entre 10^-4 y 10^-3 pb^-1 generación^-1 (McKean et al., 1984; Berek y Milstein, 1988).

La posibilidad de que las estirpes celulares linfoides puedan proporcionar un sistema tratable para investigar la hipermutación fue considerada hace muchos años (Coffino y Scharff, 1971; Adetugbo et al., 1977; Brüggemann et al., 1982). Evidentemente, es importante que la velocidad de mutación del gen V en la estirpe celular en estudio sea suficientemente elevada no solamente para proporcionar un ensayo operable sino también que asegure que las mutaciones son generadas verdaderamente por el mecanismo de hipermutación de anticuerpos localizado en lugar de reflejar una velocidad de mutación generalmente aumentada ya que está asociada de forma característica a muchos tumores. Se han realizado exhaustivos estudios sobre mutación controlando la reversión de los codones de terminación en V_H en estirpes celulares pre-B y de plasmocitoma de ratón (Wabl et al., 1985; Chui et al., 1995; Zhu et al., 1995; estudiado por Green et al., 1988). La estrategia alternativa del secuenciado directo del gen V expresado ha indicado que la diversificación del gen V_H en varios linfomas foliculares, de Burkitt y Hodgkin puede continuar después del caso de transformación inicial (Bahler y Levy, 1992; Jain et al., 1994; Chapman et al., 1995 y 1996; Braeuninger et al., 1997). El secuenciado directo ha puesto de manifiesto también una extensión baja de mutaciones en una línea de linfoma folicular clonado exponiendo que la diversificación de V_H puede continuar in vitro (Wu et al., 1995). Ninguno de los informes de la mutación constitutiva en las estirpes celulares mencionadas anteriormente proporciona pruebas de que las mutaciones observadas son el resultado de la hipermutación directa, como se observa en la diversificación del anticuerpo natural, que se concentra en los genes V, en oposición a la propensión general a la mutación tal como se describe en muchas estirpes celulares tumorales de diferentes linajes.

Recientemente, la hipermutación se ha provocado en una estirpe celular por Denepoux et al. (1997), cultivando las células en presencia de anticuerpo antiinmunoglobulina y linfocitos T activados. Sin embargo, la hipermutación observada se indicó que era provocada, no constitutiva.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento tal como se describe en las reivindicaciones adjuntas. También se describe en ésta un procedimiento para preparar una estirpe celular linfoide capaz de hipermutación constitutiva dirigida de una región de ácido nucleico diana que comprende la identificación de una población celular para continuar la diversificación de la secuencia diana, y seleccionar una célula en la que la velocidad de mutación del ácido nucleico diana supere la de otra mutación de ácido nucleico en un factor de 100 o más.

Tal como se utiliza en la presente memoria "hipermutación constitutiva dirigida" se refiere a la capacidad, observada por primera vez en los experimentos descritos en la presente memoria, de determinadas estirpes celulares para producir la alteración de las secuencia de ácido nucleico de una o más secciones específicas del ADN endógeno o transgénico de manera constitutiva, que está sin el requisito de estimulo externo. En las células capaces de hipermutación constitutiva dirigida, las secuencias fuera de las secciones específicas del ADN endógeno o transgénico no están sometidas a velocidades de mutación...

1. Procedimiento para preparar un producto génico que presenta una actividad deseada, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichas poblaciones clonales de células de la etapa (c) se seleccionan determinando la presencia de hipermutación en el ácido nucleico que codifica dicho producto génico de la célula o células.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la célula o células dirigen la hipermutación constitutiva a una secuencia de codificación de la región del gen V endógeno.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas secuencias de control que dirigen la hipermutación se seleccionan de entre las secuencias que se producen corriente abajo de un grupo del gen J.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las secuencias de control comprenden elementos Ei/MAR, regiones flanqueantes C-? y E3' definido según Klix et al., (1998) Eur. J. Immunol. 28:317-326.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho ácido nucleico que codifica dicho producto génico ligado funcionalmente a las secuencias de control que dirigen la hipermutación es una secuencia de codificación exógena heteróloga insertada en la célula o células.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que una secuencia de codificación de la región del gen V endógeno se sustituye por una secuencia de codificación exógena heteróloga.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho producto génico es una inmunoglobulina.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho producto génico es una proteína que se une al ADN.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la actividad deseada es una actividad de unión.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el producto génico es una enzima.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha identificación de la etapa (b) se basa en FACS.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha identificación de la etapa (b) se basa en la unión a perlas magnéticas.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicha identificación de la etapa (b) se basa en la selección por afinidad.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicha identificación de la etapa (b) se basa en la actividad enzimática.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha selección de la etapa (c) se basa en FACS.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicha selección de la etapa (c) se basa en la unión a perlas magnéticas.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que dicha selección de la etapa (c) se basa en la selección por afinidad.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que dicha selección de la etapa (c) se basa en la actividad enzimática.