Polimerasas de ADN que incorporan análogos de nucleótidos marcados con colorante.

Una polimerasa de ADN modificada genéticamente con una gama más amplia de sustratos siendo capaz lapolimerasa de incorporar una mayor presencia de un análogo de nucleótido marcado con colorante en un ácidonucleico sintetizado por esa polimerasa modificada genéticamente,

en comparación con la polimerasa de tiposilvestre a partir de la cual se obtiene, en donde la polimerasa se describe con cualquier secuencia de aminoácidosque tiene al menos 70% de identidad con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las siguientessecuencias: 1, 4, 8, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48, y que comprende lassiguientes mutaciones por sustitución en comparación con la secuencia de aminoácidos de Pfu de tipo silvestre:N400G/N400D y R407I.

Polimerasas de ADN que incorporan análogos de nucleótidos marcados con colorante.

Campo de la invención La presente invención se refiere a polimerasas de ADN. En particular, la invención se refiere a polimerasas de ADN con una mayor capacidad para incorporar análogos de nucleótidos que son portadores de sustituyentes marcados con agentes de detección. Los usos de tales polimerasas modificadas genéticamente también se describen.

Antecedentes Una replicación eficaz y precisa del ADN es crucial para el mantenimiento, la transmisión y la expresión de la información genética. Las polimerasas de ADN de gran fidelidad son las principales enzimas responsables de mantener la integridad del genoma. Para evitar las consecuencias negativas de mutaciones (enfermedades hereditarias y esporádicas) las polimerasas de ADN de gran fidelidad realizan una asombrosa proeza de reconocimiento molecular, seleccionando la molécula de nucleótido trifosfato correcta (dNTP) entre un grupo de sustratos muy similares y catalizando su incorporación tal y como está especificada por la base del molde. La síntesis de ADN mediante polimerasas de ADN con una prueba de lectura exonucleolítica insuficiente tiene lugar con tasas de error que van desde 10-3 hasta >10-6 por pareja de bases (Kunkel y Bebenek, 2000; Tippen et al., 2004) . Aunque en la naturaleza una gran fidelidad de la polimerasa es vital para una replicación exacta del ADN, tiene serios inconvenientes para muchas aplicaciones biotecnológicas. En concreto, se restringe el uso de bases de nucleótidos no naturales o modificadas y las aplicaciones que permiten.

Las tecnologías que se basan en la fluorescencia han sustituido a la detección radioisotópica como opción preferida para marcar y detectar biomoléculas. La incorporación de nucleótidos marcados con fluorescencia en ácidos nucleicos es fundamental para técnicas, tales como la secuenciación de ADN, el análisis de la expresión génica en micromatrices (Schena et al., 1995) micromatrices de tejidos (TMA; Kononen et al., 1998) , hibridaciones comparativas del genoma (CGH; Kallioniemi et al., 1992) e hibridación in situ fluorescente (FISH; McNeil et al., 1991) . Las metodologías para marcar el ácido nucleico con fluorescencia se han desarrollado basándose en una modificación enzimática (incorporación directa del colorante fluorescente) o una modificación química (incorporación indirecta del colorante fluorescente) .

La incorporación directa de nucleótidos marcados con colorante emplea enzimas polimerasas y está limitada por el hecho de que las enzimas polimerasas han evolucionado para conservar una gran selectividad para su sustrato nucleotídico correcto. Como tales, la mayoría de las enzimas polimerasas presentes en la naturaleza o comercialmente disponibles, discriminan los nucleótidos portadores de grupos laterales voluminosos, tales como restos fluorescentes, o los incorporan con niveles bajos, mostrando un sesgo significativo de la secuencia (Zhu y Waggoner, 1997; Zhu et al., 1994) . Por lo tanto, la mayoría de los protocolos para marcar enzimáticamente con fluorescencia utilizan el nucleótido marcado con colorante, marcado con un porcentaje bajo, en una mezcla de reacción estándar (Reid et al., 1992) . Sin embargo, incluso con estas condiciones, la enzima polimerasa todavía sigue favoreciendo al nucleótido natural sobre el nucleótido modificado (Zhu et al., 1994) .

Para superar las bajas densidades de fluoróforo obtenidas con métodos de marcación directa, se han desarrollado tecnologías de marcación indirecta, en donde un nucleótido menos voluminoso modificado con amina se incorpora directamente en el ácido nucleico y el marcador fluorescente se acopla químicamente con el nucleótido, a través del grupo amino reactivo después de la síntesis del ácido nucleico (Cox y Singer, 2004) . Aunque se pueden alcanzar mayores densidades de marcación fluorescente de ácidos nucleicos por métodos de marcación indirecta, no se ha logrado una sustitución completa de cada nucleótido reactivo.

Las sondas de ácido nucleico con una mayor densidad de marcadores (hasta 100% de sustitución) son deseables ya que se espera que incrementen la sensibilidad de la detección. Además, 100% de sustitución de cada base con su equivalente modificado con fluorescencia, es un requisito previo de muchas técnicas de secuenciación de una molécula aislada (Shendure et al., 2004) . Con los métodos indirectos actuales para marcar el ADN, que permiten marcar el 100% de las posiciones disponibles, los esfuerzos en la investigación se han centrado en la identificación de enzimas polimerasas de ADN de origen natural o mutante que son menos estrictas con respecto a su especificidad con el sustrato.

Tales esfuerzos han tenido un éxito moderado. Específicamente, varios miembros de las familias evolutivas A (similar a PolI; Brakmann y Nieckchen, 2001; Anderson et al., 2005; Yu et al., 1994; Tasara et al., 2003; Augustin et al., 2001; Ghadessy et al., 2004; Ramanathan et al., 2005) o B (similar a PolII; Anderson et al., 2005; Augustin et al., 2001; Tasara et al., 2003; Földes-Papp et al., 2001; Glick et al., 2002; Jäger y Famulok, 2004; Obayashi et al., 2002; Ono et al., 1997) de enzimas polimerasas de ADN (Zhu e Ito, 1994) , han sido identificados por ser capaces de incorporar nucleótidos marcados con fluorescencia. En el caso de enzimas que albergan actividad polimerasa, así como actividad de prueba de lectura, la obtención del ADN marcado con colorante se mejoró mediante el uso de sus mutantes con exonucleasa defectuosa.

La capacidad de la mayoría de las enzimas polimerasas para incorporar nucleótidos marcados con fluorescencia se había investigado solamente por análisis de extensión con cebadores, generando ADN monocatenario marcado con fluorescencia. La incorporación mediante PCR de nucleótidos marcados con fluorescencia permite marcar y amplificar simultáneamente el ADN. Sin embargo, en contraposición a las reacciones de extensión con cebadores, tras unos pocos ciclos de amplificación con PCR, el nucleótido fluorescente también está presente en la hebra del molde. Esto tiene consecuencias para la amplificación con PCR, ya que la polimerasa se detiene con frecuencia o interrumpe la copia y el rendimiento de ADN marcado disminuye a medida que la incorporación de nucleótidos fluorescentes aumenta, presumiblemente debido a efectos de amontonamiento estérico (Zhu y Waggoner, 1994) . En consecuencia, existe una necesidad de enzimas polimerasas capaces de incorporar eficazmente análogos de nucleótidos fluorescentes con una densidad elevada, mediante PCR, y sigue existiendo una necesidad en la técnica de polimerasas, en particular de polimerasas de ADN, que sean capaces de incorporar un marcador para la detección con densidad elevada y/o capaces de incorporar el marcador para la detección en fragmentos grandes de ADN bicatenario.

Compendio de la invención La presente invención modificaba los principios de la autorreplicación compartimentalizada (CSR, del inglés “compartmentalised self replication”; Ghadessy et al., 2001) para reducir la discriminación frente a análogos de nucleótidos marcados con colorante (marcadores con agente de detección) , en particular Cy5-dCTP y Cy3-dCTP (los nucleótidos marcados con colorante utilizados más comúnmente para marcar sondas de micromatrices) . De esta manera, los inventores fueron capaces de identificar una cantidad de polimerasas que permitieron la síntesis de sondas de ácidos nucleicos con marcadores con agentes de detección relevantes, en particular, agentes de detección con fluoróforo.

Por lo tanto, en el primer aspecto, la presente invención proporciona una polimerasa de ADN modificada genéticamente con una gama más amplia de sustratos, siendo capaz la polimerasa de incorporar una mayor presencia de un análogo de nucleótido marcado con colorante en un ácido nucleico sintetizado por esta polimerasa modificada genéticamente, en comparación con la polimerasa de tipo silvestre a partir de la cual se ha obtenido, en donde la polimerasa se describe con cualquier secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las siguientes: SEQ ID NOs 1, 4, 8, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48, y que comprende las siguientes mutaciones por sustitución en comparación con la secuencia de aminoácidos de Pfu de tipo silvestre: N400G/N400D y R407I.

El término "mutante" se utiliza en esta memoria para referirse a una secuencia polipeptídica o de nucleótidos que tiene una secuencia que difiere de la secuencia de tipo silvestre en una o varias adiciones, sustituciones o deleciones.

La polimerasa modificada... [Seguir leyendo]

1. Una polimerasa de ADN modificada genéticamente con una gama más amplia de sustratos siendo capaz la polimerasa de incorporar una mayor presencia de un análogo de nucleótido marcado con colorante en un ácido nucleico sintetizado por esa polimerasa modificada genéticamente, en comparación con la polimerasa de tipo silvestre a partir de la cual se obtiene, en donde la polimerasa se describe con cualquier secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las siguientes secuencias: 1, 4, 8, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48, y que comprende las siguientes mutaciones por sustitución en comparación con la secuencia de aminoácidos de Pfu de tipo silvestre: N400G/N400D y R407I.

2. Una polimerasa modificada genéticamente según la reivindicación 1, en la que el análogo de nucleótido marcado con colorante es un análogo de nucleótido marcado fluorescente.

3. Una polimerasa modificada genéticamente según la reivindicación 2, en la que el marcador fluorescente se selecciona entre el grupo que consiste en colorante Alexa Fluor®, dietilaminocumarina, tetrametilrodamina, N-metilantraniloilo, trinitrofenilo, derivados de eteno, fluoresceína o carbocianina.

4. Una polimerasa modificada genéticamente según la reivindicación 3, en la que el análogo de nucleótido marcado con colorante es un análogo de nucleótido marcado con carbocianina.

5. Una polimerasa modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el análogo de nucleótido marcado con colorante se selecciona entre el grupo que consiste en Cy5-dNTP y Cy3dNTP.

6. Una polimerasa modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el análogo de nucleótido marcado con colorante se selecciona entre el grupo que consiste en Cy5-dCTP o Cy3-dCTP.

7. Una polimerasa modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la polimerasa tiene una o varias de las siguientes mutaciones: V337I, E399D y/o Y546H.

8. Una polimerasa modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que está descrita por la secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO 1 y se designa E10 en esta memoria, o es al menos 70%, 80%, 90% o 99% idéntica a la que se designa E10 en la presente memoria y se describe en SEQ ID NO 1.

9. Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una polimerasa modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 70% de identidad con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs 2, 3, 5, 9, 13, 15, 17, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 y 47.

10. Una polimerasa de ADN modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la polimerasa de ADN modificada genéticamente (i) se obtiene a partir de una polimerasa de ADN mediante sustitución, deleción o inserción de uno o varios aminoácidos; y/o (ii) se selecciona a partir del grupo que consiste en polimerasas polA, polimerasas polB y polimerasas pfu.

11. Un método para la incorporación de análogos de nucleótidos marcados con colorante en ácido nucleico recién sintetizado, comprendiendo el método el uso de una polimerasa modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

12. El uso de una polimerasa modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la síntesis de ácido nucleico que comprende la detección de análogos de nucleótidos marcados con colorante.

13. El uso según la reivindicación 12, en donde el análogo de nucleótido marcado con colorante es un análogo de nucleótido marcado con colorante fluorescente.

14. El uso según la reivindicación 13, en donde el análogo de nucleótido marcado con colorante fluorescente se selecciona entre el grupo que consiste en los siguientes: Cy3-CTP, Cy5-CTP.

15. El uso de una polimerasa modificada genéticamente con una gama más amplia de sustratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y 10, en una o varias técnicas biotecnológicas en el grupo que consiste en las técnicas siguientes: reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ; análisis con micromatrices (tal como análisis con micromatrices de expresión génica, micromatrices tisulares, hibridaciones genómicas comparativas en micromatriz) ; hibridación in situ fluorescente (FISH) ; FISH con fibras; hibridaciones genómicas comparativas; secuenciación de ADN, secuenciación de ácido nucleico, (p. ej., secuenciación de ácido nucleico monocatenario) y detección de moléculas aisladas.

16. El uso según la reivindicación 15, en donde la polimerasa de ADN modificada genéticamente se describe

por la secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO 1.

17. Un kit para incorporar una mayor presencia de análogo de nucleótido marcado con un agente de detección en un ácido nucleico que comprende una polimerasa de ADN aislada modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y 10.