Polimerasa.

Una ADN polimerasa pol A con una selección más amplia de sustratos que es capaz de evitar un sitio abásico,

en la que la polimerasa comprende la secuencia de aminoácidos del clon designado en el presente documento como 3A10 (SEC ID Nº 80).

Polimerasa

La presente invención se refiere a ADN polimerasas. En particular, la invención se refiere a ADN polimerasas que presentan una especificidad de sustrato relajada. También se describen usos de las polimerasas obtenidas por ingeniería genética usando los métodos de la invención.

Antecedentes

La replicación precisa del ADN es de importancia crucial para la vida, garantizando el mantenimiento y la transmisión del genoma y la limitación de la tumorigénesis en los organismos superiores. Las ADN polimerasas de alta fidelidad realizan una asombrosa proeza de reconocimiento molecular, incorporando las moléculas de sustrato de nucleótidos trifosfato correctas (dNTP) según lo especificado por la base del molde con tasas de error mínimas. Por ejemplo, incluso sin la prueba de lectura exonucleolítica, la ADN polimerasa III replicativa de E. coli solo da lugar, como media, a un error en ~105 pares de bases (Schaaper JBC 1993).

Dado que las diferencias energéticas entre los nucleótidos apareados correcta y erróneamente en sí son demasiado pequeñas para dar lugar a una discriminación de 105 veces, la estructura del sitio activo de la polimerasa en polimerasas de alta fidelidad ha evolucionado para mejorar esas diferencias. Recientes estudios estructurales de las ADN polimerasas de la familia A (de tipo Pol I) de Thermus aquaticus (Taq) (Li 98), fago T7 (Ellenberger) y B. stearothermophilus (Bst) (Beese) han revelado, en particular, cómo los cambios conformacionales producidos durante el ciclo catalítico pueden excluir las geometrías de formación de pares de bases no afines a causa de los enfrentamientos estéricos dentro del sitio activo cerrado. Como resultado de estas ajustadas limitaciones estéricas, no solo se excluyen los nucleótidos desapareados, sino que la catálisis se vuelve exquisitamente sensible incluso a las ligeras distorsiones producidas en el dúplex de cebador-molde. Esto impide o reduce en gran medida la replicación de los moldes de ADN modificados o dañados, la incorporación de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) modificados o artificiales y la extensión de los extremos 3 desapareados o artificiales.

Aunque deseable en la naturaleza, dicha discriminación rigurosa del sustrato es limitante para muchas aplicaciones biotecnoloógicas. En concreto, restringe el uso de bases de nucleótidos artificiales o modificadas y las aplicaciones que permiten. También se opone a la amplificación por PCR eficaz de los moldes de ADN dañados.

Algunas otras polimerasas de origen natural son menos rigurosas con respecto a su especificidad de sustrato. Por ejemplo, las transcriptasas inversas virales como la transcriptasa inversa del VIH-1 o la transcriptasa inversa del AMV, y las polimerasas capaces de realizar la síntesis translesión tales como las polimerasas de la familia pol-Y, pol-X (Vaisman et al, 2001, JBC) o pol-X (Washington (2002), PNAS; o la poco común polimerasa de la familia pol-B pol X (Johnson, Nature), todas extienden desapareamientos en 3 con alta eficacia en comparación con las polimerasas de alta fidelidad. La desventaja del uso de polimerasas de síntesis translesión para usos biotecnológicos es que dependen de factores de capacidad de procesamiento celulares para su actividad, tales como PCNA. Además, dichas polimerasas no son estables a las temperaturas a las que se realizan ciertas técnicas biotecnológicas, tales como la PCR. Es más, la mayoría de las polimerasas de síntesis translesión tiene una fidelidad muy reducida, lo que comprometería gravemente su utilidad para la clonación.

Usando otra metodología, la disponibilidad de estructuras de alta resolución ha enfocado los esfuerzos hacia la modificación racional de la especificidad de sustrato de las ADN polimerasas de alta fidelidad, por ejemplo, por mutagénesis dirigida para aumentar la aceptación de los didesoxinucleótidos (ddNTP) (Li 99) o ribonucleótidos (rNTP) (Astatke 98). La complementación in vivo seguida de la selección también ha producido variantes de polimerasa con mayor incorporación de rNTP y forma limitada de evitar las lesiones de molde (Patel 01). Recientemente, se han descrito dos estrategias in vitro diferentes para la selección de la actividad de la polimerasa (Jestin 00, Ghadessy 01, Xia 02). Una se basa en la unión próxima de la polimerasa y del dúplex de molde-cebador en la misma partícula de fago, y ha permitido el aislamiento de mutantes de la Polimerasa Taq, que incorporan rNTP y dNTP con una eficacia comparable (Xia 02). Sin embargo, dichos métodos son complejos, propensos a generar errores y laboriosos.

Recientemente, la técnica de la autorreplicación compartimentalizada (CSR) (Ghadessy 01), que se basa en la autorreplicación de genes de polimerasa por las polimerasas codificadas dentro de compartimentos diferenciados no comunicantes, ha permitido la selección de mutantes de Polimerasa Taq con una mayor termoestabilidad y/o resistencia al potente inhibidor heparina (Ghadessy et al 01).

El documento WO 02/22869 describe métodos para su uso en la evolución in vitro de genotecas moleculares. Se describen métodos de selección de ácidos nucleicos que codifican productos génicos en los que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado están relacionados por la compartimentalización.

Sin embargo, todavía sigue existiendo la necesidad en la técnica de un método eficaz y sencillo para relajar la especificidad de sustrato de las ADN polimerasas de alta fidelidad, a la vez que se mantiene la alta rotación

catalítica y capacidad de procesamiento de los fragmentos de ADN hasta varias decenas de kb. Dichas polimerasas serán de uso particular en aplicaciones tales como la amplificación por PCR y la secuenciación de moldes de ADN dañados, para la incorporación de análogos de bases artificiales al ADN (como se requiere para la secuenciación o el mareaje matricial) y como punto de partida para la creación de nuevas actividades de la polimerasa usando la autorreplicación compartimentada u otros métodos.

Sumario de la invención

Los presentes inventores modificaron los principios de la evolución dirigida, (en particular, la autorreplicación compartimentada) descrita en los documentos GB97143002, 986063936 y GB01275643 en nombre de los presentes inventores, para relajar el control estérico de las ADN polimerasas de alta fidelidad y, por consiguiente, ampliar la selección de sustratos de dichas polimerasas. Todos los documentos mencionados anteriormente se incorporan en el presente documento por referencia.

Se encontró que, sorprendentemente, mediante la realización de la técnica de la autorreplicación compartimentada a la que se hace referencia anteriormente, usando repertorios de genes Taq mutados al azar, y cebadores flanqueantes que portan desapareamientos A*G y C*C en su terminal/extremo 3, se generaron mutantes que no solamente presentaban la capacidad de extender los desapareamientos de transversión A*G y C*C usados en la selección de CSR, sino que, sorprendentemente, también presentaron una capacidad genérica para extender los extremos 3 desapareados. Este hallazgo es especialmente significativo, ya que la Polimerasa Taq no es capaz de extender los desapareamientos de 3 (Kwok ef al, (1990), Huang (1992). Las polimerasas mutantes generadas también presentan una alta rotación catalítica, concomitante con otras polimerasas de alta fidelidad, y son capaces de realizar la amplificación eficaz de fragmentos de ADN de hasta 26 kb.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una ADN polimerasa de pol A con una selección más amplia de sustratos, que es capaz de evitar un sitio abásico, polimerasa que comprende la secuencia de ácido nucleico del clon designado en el presente documento como 3A10 (SEC ID N° 80).

La ADN polimerasa puede consistir en la secuencia de aminoácidos del clon designado en el presente documento como 3A10 (SEC ID N° 80).

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que codifica una polimerasa obtenida por ingeniería genética de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere al uso de una ADN polimerasa obtenida por ingeniería genética de acuerdo con el primer aspecto de la invención en una cualquiera o más de las siguientes aplicaciones seleccionadas del grupo que consiste en las siguientes: amplificación por PCR, secuenciación de moldes de ADN dañados, la incorporación de análogos de bases artificiales a ADN y la creación de nuevas actividades polimerasa.

1. Una ADN polimerasa pol A con una selección más amplia de sustratos que es capaz de evitar un sitio abásico, en la que la polimerasa comprende la secuencia de aminoácidos del clon designado en el presente documento como

3A10 (SEC ID N° 80).

2. Una ADN polimerasa pol A de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la DNA polimerasa consiste en la secuencia de aminoácidos del clon designado en el presente documento como 3A10 (SEC ID N° 80).

3. Una construcción de ácido nucleico que codifica una polimerasa obtenida por ingeniería genética de acuerdo con

la reivindicación 1 o 2.

4. Un vector que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3.

5. El uso de una ADN polimerasa obtenida por ingeniería genética de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en una

cualquiera o más de las siguientes aplicaciones seleccionadas del grupo que consiste en las siguientes: amplificación por PCR, secuenciación de moldes de ADN dañados, la incorporación de análogos de bases artificiales a ADN y la creación de nuevas actividades de polimerasa.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5 de una combinación de polimerasas obtenidas por ingeniería genética.