Proteína marcada de unión a DNA monocatenario y su uso en un biosensor para detectar y visualizar un DNA monocatenario.

Una proteína de dominio de unión de DNA monocatenario, familia SSB,

que comprende al menos un marcador detectable unido a un aminoácido de la proteína, en donde las características del marcador detectable se modifican al unir DNA monocatenario.

Proteïna marcada de uniïn a DNA monocatenario y su uso en un biosensor para detectar y visualizar un DNA monocatenario

Campo de la tïcnica Esta invenciïn se refiere a ensayos de DNA monocatenario, particularmente a la detecciïn y visualizaciïn de DNA monocatenario en soluciones biolïgicas. Mïs particularmente, la presente invenciïn se refiere a una proteïna modificada de dominio de uniïn de DNA monocatenario, familia SSB, y al uso de una proteïna tal en un ensayo biolïgico.

Antecedentes de la tïcnica La formaciïn y mantenimiento de DNA monocatenario (ssDNA) es una parte importante de muchos procesos que implican DNA. Por ejemplo, la separaciïn de cadenas de DNA de doble hïlice (bicatenario) (dsDNA) estï catalizada por helicasas y esta exposiciïn de las bases situadas sobre el DNA permite un tratamiento posterior, tal como la reparaciïn o replicaciïn. Los ensayos de actividad de helicasas son una parte importante de la comprobaciïn de procesos biolïgicos relacionados.

Aun cuando existen mïtodos para medir ssDNA, en oposiciïn a dsDNA, en ensayos en tiempo real, la sensibilidad y la resoluciïn en tiempo han sido limitadas. En general, ensayos basados en fluorescencia han proporcionado la combinaciïn de alta sensibilidad y alta resoluciïn en tiempo que se requieren para estos tipos de medidas. Hay varios colorantes que proporcionan seïales de fluorescencia para verificar la transformaciïn de dsDNA en ssDNA. [1, 2], pero muchos de ellos se unen especïficamente en las estrïas del dsDNA y la fluorescencia disminuye al

desprenderse del DNA a medida que tiene lugar la separaciïn de las cadenas. Este tipo de sonda puede no ser adecuado para extensiones de reacciïn bajas, dado que se basa en la medida de una pequeïa disminuciïn de fluorescencia frente a un ruido de fondo grande. Ademïs, los colorantes que se unen a DNA bicatenario pueden inhibir las enzimas que actïan sobre tal DNA.

La obtenciïn de un cambio cuantitativo de seïal combinado con especificidad para el ssDNA y la discriminaciïn frente a otras molïculas similares, tales como dsDNA, que pueden encontrarse presentes en el ensayo, proporciona un reto cientïfico considerable.

D4 (Wan y Le 2000 Anal. Chem. vol. 72, pïginas 5583-5589) describen estudios de interacciones de proteïna-DNA por polarizaciïn de fluorescencia inducida por electroforesis capilar/lïser.

D5 (US2005/0037377) describe la detecciïn de factores de uniïn con polarizaciïn de fluorescencia.

Descripciïn de la invenciïn En la presente invenciïn se ha puesto de manifiesto que la modificaciïn de una proteïna de dominio de uniïn de DNA monocatenario, familia SSB, (en lo sucesivo denominada en esta memoria simplemente SSB) , con objeto de unir un marcador fluorescente, da como resultado una SSB modificada que es capaz de actuar como biosensor sin requerir cofactores. La SSB interacciona con DNA monocatenario y DNA bicatenario desenrollado, La proteïna modificada puede utilizarse en ensayos cinïticos con alta sensibilidad y alta resoluciïn en tiempo para comprobar el desenrollamiento de dsDNA, por ejemplo en ensayos en tiempo real de la actividad de helicasas in vitro, o en aplicaciones tales como estudios de molïculas aisladas y ensayos de alta productividad.

Asï pues, la invenciïn proporciona una SSB modificada que comprende, al menos, un marcador detectable unido a un aminoïcido de la proteïna, en donde las caracterïsticas del marcador detectable se alteran al unir DNA

monocatenario.

Un cambio de fluorescencia intrïnseca ha sido observado antes en relaciïn con la SSB. Existe una disminuciïn de fluorescencia del triptïfano cuando la SSB se une a DNA, y este hecho ha sido utilizado como sonda para la separaciïn de cadenas de DNA [3] e interacciones de SSB-DNA [15]. No obstante, estos ensayos demuestran una sensibilidad menor en uno o dos ïrdenes de magnitud que el uso de la SSB modificada de la presente invenciïn.

Ademïs, los ensayos que se basan en los cambios de la fluorescencia intrïnseca del triptïfano tienen limitaciones debidas a fotoblanqueo y a interferencia procedente de otras especies que absorben en la misma regiïn de radiaciones UV que el triptïfano. Tambiïn se ha preparado SSB marcada isotïpicamente [46].

Biosensores que no requieren cofactores y que estïn basados en proteïnas fluorescentes han tenido ïxito en varios casos proporcionando sondas rïpidas de concentraciïn de molïculas en ensayos biolïgicos. Tales biosensores 50 reaccionan con la molïculas de interïs produciendo un cambio de seïal de la fluorescencia. Existen diversos ejemplos de este tipo de biosensores sin reactivo, tales como de fosfato [4]. glucosa [5] y maltosa [6]. Varios estudios realizados describen este enfoque general [7, 8 y 9].

La familia de proteïnas de dominio de uniïn de DNA monocatenario: La familia de proteïnas de dominio de uniïn de DNA monocatenario (familia SSB) constituye un ejemplo de una familia de proteïnas que interaccionan con DNA monocatenario y DNA bicatenario desenrollado. Esta familia de proteïnas estï definida en la base de datos SCOP [10] y posee una estructura todo-beta con un pliegue OB (barrilete, cerrado; n=5, S=10) . Es la familia 50263. Esta familia es distinta de la familia SCOP 50315 que tiene la estructura de un pliegue OB (barrilete, abierto; n*=5, S*=8) . Otras proteïnas de uniïn de cadenas aisladas que no son miembros de la familia 50263 figuran descritas en [47] y [48]. La familia SSB de proteïnas desempeïa un papel esencial en la replicaciïn, recombinaciïn y reparaciïn de DNA, tanto en procariotas como en eucariotas. Han sido investigados miembros de esta familia de proteïnas que proceden de diversos organismos procarïoticos y existen estructuras de la proteïna que procede de Escherichia coli, en presencia y ausencia de DNA.

La SSB puede ser eucariïtica o procariïtica. La SSB procariïtica puede ser bacteriana. Como ejemplos de SSBs bacterianas se incluyen las representadas en la Figura 8, tales como E. coli, Salmonella typhimurium, Bacillus licheniformis, Campylobacter jejuni, Pseudomonas syringae y Listeria innocua, asï como tambiïn T. aquaticus,

M. smegmatis y D. radiodurans.

Preferiblemente, la SSB modificada de la presente invenciïn es una proteïna SSB de E. coli. modificada La secuencia de la SSB de E. coli nativa es como sigue (nïmero de catïlogo gil 790494; SEQ ID NO: 1 en esta memoria) :

MASRGVNKVILVGNLGQDPEVRYMPNGGAVANITLATSESWRDKATGEMKEQTEWHRVVLFGKLAEVASEYLRKGS QVYIEGQLRTRKWTDQSGQDRYTTEVVVNVGGTMQMLGGRQGGGAPAGGNIGGGQPQGGWGQPQQPQGGNQF SGGAQSRPQQSAPAAPSNEPPMDFDDDIPF.

La metionina del extremo N-terminal se separa durante la expresiïn dando lugar a la proteïna madura (vïase SEQ ID NO: 6) . La numeraciïn de aminoïcidos que se utiliza en esta memoria se refiere a la proteïna madura que comienza en Ala-2 de la SEQ ID NO:1.

La SSB que procede de E. coli es codificada por el gen ssb de E. coli. Existe como un tetrïmero estable que puede unir un mïnimo de !65 bases de DNA en concentraciones salinas altas [11] y la estructura del cristal pone de 25 manifiesto DNA enrollado en torno a un tetrïmero [12]. En concentraciones salinas bajas la SSB de E. coli puede unir una longitud de !35 bases de ssDNA.. La estructura del cristal en ausencia de DNA pone de manifiesto una disposiciïn de monïmeros diferente dentro de un tetrïmero [13]. La proteïna une DNA rïpida y estrechamente, pero el mecanismo puede ser complejo debido a la necesidad de que el DNA se enrolle en torno a la SSB de E. coli [14, 15]. La uniïn es aparentemente cooperativa y puede haber interacciïn entre oligïmeros de SSB vecinos a lo largo de una cadena de ssDNA. Tambiïn existe evidencia de que la SSB de E. coli puede existir como un monïmero en concentraciones bajas y puede unir dïbilmente DNA en este estado [16].

Al unir a DNA monocatenario, las SSBs pueden sufrir un cambio de conformaciïn. Sin embargo, las estructuras de cristales de SSB sugieren que solamente hay cambios menores de la conformaciïn de subunidades de la proteïna en la asociaciïn con DNA [12, 13]. Al enrollarse en torno a la superficie del tetrïmero, el DNA lo hace por medio de una serie de canales existentes en la superficie de la proteïna.

Marcadores La SSB de la invenciïn se modifica con objeto de que incluya un marcador detectable unido a un aminoïcido de la proteïna y cuyas caracterïsticas detectables se modifican al unir DNA monocatenario. Esta modificaciïn puede resultar, pero no necesariamente, de un cambio de la conformaciïn de la proteïna. Tanto como si la modificaciïn se debe a un cambio de la conformaciïn de la proteïna como si no, el cambio de las caracterïsticas detectables se debe a una modificaciïn del... [Seguir leyendo]

1. Una proteïna de dominio de uniïn de DNA monocatenario, familia SSB, que comprende al menos un marcador detectable unido a un aminoïcido de la proteïna, en donde las caracterïsticas del marcador detectable se modifican al unir DNA monocatenario.

2. Una proteïna segïn la reivindicaciïn 1, que es sensible a la uniïn de DNA monocatenario, en donde el marcador detectable se une a una regiïn de la superficie de la proteïna.

3. Una proteïna segïn la reivindicaciïn 1 o la reivindicaciïn 2, en donde el marcador detectable se une por medio de un resto de cisteïna de la proteïna.

4. Una proteïna segïn la reivindicaciïn 3, en donde el resto de cisteïna ha sido construido en la secuencia de la 10 proteïna.

5. Una proteïna segïn cualquier reivindicaciïn precedente, que es una SSB de E. coli modificada.

6. La proteïna segïn la reivindicaciïn 5, en donde la SSB de E. coli modificada tiene una secuencia de aminoïcidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO: 4.

7. Una proteïna segïn la reivindicaciïn 4, que es una SSB de E. coli mutada que tiene una secuencia de SEQ ID

NO: 1 que comprende: i) la mutaciïn S92C, G26C o W88C, o ii) un resto de cisteïna construido en la secuencia de la proteïna para reemplazar a uno o mïs de los restos M23-A28 y K87-Q94.

8. Una proteïna segïn cualquier reivindicaciïn precedente, en donde el marcador detectable es un marcador 20 fluorescente.

9. La proteïna segïn la reivindicaciïn 8, en donde el marcador detïctale es una cumarina o una rodamina.

10. Una proteïna segïn la reivindicaciïn 9, en donde el marcador se selecciona del grupo que consiste en cumarinas tales como N-[2- (yodoacetamido) etil]-7-dietilaminocumarina-3-carboxamida; MANS, ïcido 2- (4’maleimidilanilino) naftaleno-6-sulfïnico (IDCC) , N-[2- (1-maleimidil) etil]-7-dietilaminocumarina-3-carboxamida (MDCC) ,

Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 546, y rodaminas tales como 6-yodoacetamidotetrametilrodamina (6-IATR) .

11. Una proteïna segïn la reivindicaciïn 10, en donde el marcador es IDCC ï 6-IATR.

12. Una proteïna segïn cualquier reivindicaciïn precedente, que comprende mïs de un marcador detectable.

13. Un procedimiento de preparaciïn de una proteïna SSB segïn cualquier reivindicaciïn precedente, que comprende la modificaciïn de una SSB para incluir un marcador detectable unido a un aminoïcido de la proteïna.

14. Un mïtodo para detectar DNA monocatenario en una muestra, que comprende las etapas de:

(i) mezclar la muestra con la proteïna segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1-12; y

(ii) detectar un cambio en la mezcla que proviene de la interacciïn entre el DNA monocatenario y la proteïna SSB,

15. Un mïtodo de selecciïn de inhibidores de enzimas de tratamiento de DNA, que comprende analizar los niveles de DNA monocatenario in vitro empleando una SSB segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 en presencia 35 y ausencia de los inhibidores, y analizar una alteraciïn de los niveles de DNA monocatenario.