Composiciones y métodos para provocar el crecimiento de neuritas.

Un método in vitro para reducir la inhibición del crecimiento de neuritas de una neurona,

en donde dicha neurona comprende un receptor de Nogo,

en donde dicho método comprende poner en contacto dicha neurona con una composición capaz de causar la fosforilación de un receptor de Nogo, en donde dicha composición comprende proteína cinasa A o caseína cinasa II.

Composiciones y métodos para provocar el crecimiento de neuritas Campo de la invención La invención se refiere al campo de lesión o enfermedad neurológica, en particular, la invención se refiere a la reducción de la inhibición de la regeneración neuronal, tal como el crecimiento de neuritas.

Antecedentes de la invención Las neuronas extienden las neuritas para comunicarse con otras neuronas o con sus tejidos diana. Esta red neuronal en el sistema nervioso central (SNC) adulto se regenera solo de manera deficiente después de una lesión. Esto representa un problema en la técnica, que conduce a malos desenlaces en el paciente después de una lesión en la red neuronal.

La imposibilidad del SNC mamífero adulto de regenerarse se debe en parte a los inhibidores del crecimiento de neuritas asociados con la mielina dañada. La glucoproteína asociada con mielina (MAG) , Nogo-A (también conocida como Reticulon 4A) y la glucoproteína de mielina de oligodendrocitos (OMgp) son inhibidores asociados con mielina del crecimiento de neuritas que pueden unirse al receptor de Nogo 1 (NgR1) . Estas proteínas asociadas con mielina, Nogo-A, MAG y OMgp, transmiten señales desde los oligodendrocitos a las neuronas a través de la unión a los receptores de Nogo. Esta señalización de Nogo tiene funciones críticas en el desarrollo y mantenimiento del sistema nervioso central (SNC) . Puede inhibir la diferenciación, migración y crecimiento neurítico de las neuronas, causando la recuperación deficiente del daño al SNC adulto.

Nogo-A se une a NgR1 a través de un dominio llamado Nogo-66. El dominio Nogo-66 está compuesto por 66 aminoácidos y el dominio Nogo-66 solo, sin otras regiones de Nogo-A, es suficiente para inhibir el crecimiento de neuritas. MAG, pero ni Nogo-A ni OMgp, puede inhibir el crecimiento de neuritas no solamente a través de NgR1 sino también a través de NgR2, una proteína homóloga de NgR1 (6) .

Ng1 elabora los complejos de señalización que contienen LINGO-1 y o bien p75NTR o TAJ/TROY (McGeey Strittmatter Trends Neuro sci 26, 193-198 (2003) ; Schwab et al Trends Mol Med 12, 293-297 (2006) ) . Tanto p75NTR como TAJ/TROY pertenecen a la familia de receptores TNFalfa, y se propone que son los componentes principales que inicial las señales intracelulares para inhibición del crecimiento neurítico. NO se sabe con certeza si NgR2 elabora complejos que contienen LINGO-1 y o bien p75NTR o TAJ/TROY

Si bien la información acerca de las funciones de la señalización de Nogo se está expandiendo, la información acerca de los mecanismos que controlan la señalización es limitada. Esto implica un problema en la técnica. Se sabe que el aumento de los niveles intracelulares de cAMP supera los efectos inhibidores de la señalización de Nogo en el crecimiento de neuritas. No obstante, se desconoce el mecanismo detallado mediante el cual cAMP supera los efectos de la señalización de Nogo.

BDNF, un miembro de la familia del factor de crecimiento nervioso de neurotrofina, no solamente estimula el crecimiento de neuritas de varios tipos de células neurales in vitro (17-19, 20) , sino que también promueve parcialmente la recuperación de lesión de médula espinal (21-24) . El pre-tratamiento con BDNF incrementa los niveles de cAMP intracelular en neuronas cultivadas, permitiendo que las neuronas extiendan las neuritas incluso en presencia de inhibidores asociados con mielina (25) . Asimismo, BDNF está implicado en el rebrote de neuritas inducido por lesiones en el hipocampo (26) . Estos informes indican que BDNF podría potencialmente ayudar en la regeneración de redes neuronales en el SNC incluso en presencia de los inhibidores asociados con mielina del crecimiento de neuritas. No obstante, el efecto es limitado y no es suficiente para completar la regeneración de las redes neurales.

Una línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y exhibe crecimiento de neuritas dependiente de BDNF después de 5 días de tratamiento con ácido retinoico (RA) (18) . Las células SH-SY5Y inician la diferenciación en células de tipo neuronas y comienzan la expresión de proteínas específicas de neuronas en respuesta al RA.

No obstante, las células neurales diferenciadas de células SH-SY5Y por RA exhiben solamente cambios morfológicos limitados. Se requiere el tratamiento de BDNF para crecimiento eficiente de neuritas de células neurales derivadas de SH-SY5Y, de lo contrario, se requiere el tratamiento más prolongado con RA (27) .

Se ha estudiado la caseína cinasa II (CK2) en el contexto de neuronas. La caseína cinasa II ha estado implicada en la fosforilación de dos proteínas superficiales distintas en las neuronas.

Ninguna proteína está relacionada con los receptores de Nogo. Asimismo, los estudios en esta área han sido absolutamente dependientes del uso de inhibidores de caseína cinasa II. Por consiguiente, se ha estudiado en la técnica la función de CK2 intracelular. Se sabe que la actividad de CK2 intracelular es necesaria para el crecimiento de neuritas propiamente dicho. Se sabe que la CK2 extracelular existe. Sin embargo, la información acerca de la CK2 extracelular se desconoce en gran medida, como se observó anteriormente. En más detalle, hay datos de que

la proteína precursora de amiloide beta y neuroglicano C pueden fosforilarse en las superficies de neuronas por CK2 extracelular endógena. No obstante, se desconocen los efectos de estas fosforilaciones sobre el crecimiento de neuritas (si los hubiese) .

La caseína cinasa II se ha usado para tratar colágeno/laminina en ciertas preparaciones in vitro.

Estos tratamientos nunca han implicado células. Estos tratamientos solamente han implicado preparaciones in vitro de proteínas de matriz tales como colágeno o laminina.

No se conoce ningún tratamiento con caseína cinasa II de células en la técnica anterior. La aplicación de caseína II exógena a las células se desconoce en la técnica.

Ulloa et al (1993 EMBO vol 12 pág 1633-1640) inhibió la actividad de CK2 en la línea celular de neuroblastoma de ratón N2A con oligos antisentido y con un inhibidor específico. Las células N2A extienden las neuritas ni con ácido retinoico (RA) ni con BDNF. Usando una línea celular de N2A, hallaron que el crecimiento de neuritas a partir de células N2A se inhibe por agotamiento de CK2, y que la fosforilación de una proteína asociada con microtúbulos, MAP1B, es cambiada por el agotamiento. Se requiere MAP1B para la reordenación del citoesqueleto, que se requiere para el crecimiento de neuritas. Por lo tanto, concluyeron que el cambio de fosforilación de MAP1B causa la inhibición del crecimiento de neuritas por agotamiento de CK2. La fosforilación de MAP1B es intracelular. Se ha sabido que otras proteínas asociadas con la reordenación del citoesqueleto son fosforiladas por CK2, a nivel intracelular. Estos eventos de fosforilación intracelular son necesarios para el crecimiento de neuritas propiamente dicho. Ya que las neuronas normales, como también las células N2A, pueden extender las neuritas sin ninguna estimulación, la inferencia es que estos eventos de fosforilación intracelular son catalizados por un nivel basal de CK2 intracelular en las neuronas. La función no se relaciona con la señalización de Nogo.

No se conoce hasta la fecha ninguna relación entre la fosforilación y la señalización de Nogo. Se desconoce hasta el momento el mecanismo que controla la señalización de Nogo.

La presente invención busca superar el problema (s) asociado con la técnica anterior.

Compendio de la invención Es un problema que el tejido nervioso adulto se regenere solo de manera deficiente, o no se regenere en absoluto. Esto implica un problema particular después del daño causado por factores tales como lesiones o enfermedades. Se han identificado diversos mecanismos que rigen la inhibición de la regeneración. Uno de dichos mecanismos es la inhibición del crecimiento de neuritas por señalización a través de los receptores de Nogo. Si bien diversos ligandos y receptores en esta ruta están bien caracterizados, no ha habido una forma confiable de reducir esta inhibición descrita en la técnica anterior.

Los presentes inventores se han referido a estos problemas. A través de estudios detallados de señalización de Nogo, los inventores han identificado formas en las que puede inhibirse dicha señalización. A su vez, los inventores han identificado una diana molecular específica dentro del receptor de Nogo que es clave para la regulación de la señalización de Nogo. Esta diana es serina 281 del receptor de Nogo. La fosforilación de este residuo anula la unión de inhibidores del crecimiento de neuritas al receptor, reduciendo de este modo la inhibición de... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para reducir la inhibición del crecimiento de neuritas de una neurona, en donde dicha neurona comprende un receptor de Nogo, en donde dicho método comprende poner en contacto dicha neurona con una composición capaz de causar la

fosforilación de un receptor de Nogo, en donde dicha composición comprende proteína cinasa A o caseína cinasa II.

2. Un método in vitro según la reivindicación 1, en donde dicha composición comprende proteína cinasa A y caseína cinasa II

3. Un método in vitro según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicha fosforilación es la fosforilación de un residuo de aminoácidos correspondiente a serina 281 de dicho receptor de Nogo.

4. Un método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho receptor de Nogo es NgR1 humano.

5. El uso de un polipéptido de proteína cinasa A para la fabricación de un medicamento para tratar lesión de la médula espinal.

6. Un polipéptido de proteína cinasa A para uso en el tratamiento de lesión de la médula espinal.

7. Uso de un polipéptido de caseína cinasa II para la fabricación de un medicamento para tratar lesión de la médula espinal.

8. Polipéptido de caseína cinasa II para uso en el tratamiento de lesión de la médula espinal.

9. Una composición que comprende proteína cinasa A y caseína cinasa II, para uso como medicamento.

10. Uso de una composición según la reivindicación 9 para la fabricación de un medicamento para tratar lesión de la 20 médula espinal.

11. Una composición según la reivindicación 9 para uso en el tratamiento de lesión de la médula espinal.

12. Uso de un polipéptido de proteína cinasa A o de un polipéptido de caseína cinasa II para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad neurodegenerativa o un trastorno de mielinación.

13. Un polipéptido de proteína cinasa A o un polipéptido de caseína cinasa II para uso en el tratamiento de una 25 enfermedad degenerativa o un trastorno de mielinación.

14. Uso según la reivindicación 12, o un polipéptido de proteína cinasa A o un polipéptido de caseína cinasa II según la reivindicación 13, en donde dicha enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson.

15. Uso según la reivindicación 12, o un polipéptido de proteína cinasa A o un polipéptido de caseína cinasa II según 30 la reivindicación 13, en donde dicho trastorno de mielinación es esclerosis múltiple.