Método para la amplificación de uno o más ácidos nucleicos sobre una perla,

que comprende las etapas siguientes:

(a) formar una emulsión de agua en aceite para crear una pluralidad de microrreactores acuosos, en la que por lo menos uno de los microrreactores comprende un ácido nucleico molde monocatenario, una única perla con una primera población que comprende una pluralidad de moléculas de una primera especie de cebador dispuesta sobre la misma, y una solución de reacción de amplificación que comprende una segunda población que comprende una pluralidad de moléculas de la primera especie de cebador, una pluralidad de moléculas de una segunda especie de cebador, y reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificación de ácidos nucleicos, en donde la primera especie de cebador es capaz de unirse al ácido nucleico molde monocatenario, la segunda especie de cebador es capaz de unirse a una cadena complementaria del ácido nucleico molde monocatenario, y la concentración de la segunda especie de cebador es mayor que la de la segunda población de la primera especie de cebador en la solución de reacción de amplifica- ción,

(b) amplificar asimétricamente el molde de ácido nucleico monocatenario y la cadena complementaria a la cadena molde en la solución de reacción de amplificación, para formar una población de copias amplificadas del ácido nucleico molde monocatenario, y

(c) unir una pluralidad de las copias amplificadas asimétricamente de ácido nucleico molde monocatenario a la primera población de la primera especie de cebador sobre la perla en el microrreactor, en el que una cadena complementaria unida a perla se extiende a partir de la primera especie de cebador

Amplificación de ácidos nucleicos mediante emulsión de perlas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para amplificar ácidos nucleicos de molde a partir de un número de copia reducido hasta cantidades que permitan la secuenciación en un soporte sólido, tal como en una perla. Asimismo, la presente invención se refiere a la eliminación de perlas vacías, un método de enriquecimiento de soporte sólidos que contienen ácidos nucleicos amplificados.

Antecedentes

La capacidad de amplificar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos, tal como una biblioteca genómica o una biblioteca de ADNc, resulta crítica dada la ineficiencia de los métodos actuales de secuenciación. Las tecnologías de secuenciación actuales requieren millones de copias de ácido nucleico por cada reacción de secuenciación. Además, la secuenciación de un genoma humano requeriría aproximadamente diez millones de reacciones de secuenciación diferentes. En el caso de que el material de partida fuese limitado, resultaría necesaria la amplificación del ADN inicial antes de la secuenciación genómica. El material de partida puede ser limitado, por ejemplo si el genoma que debe secuenciarse procede de una cantidad traza de patógeno o de un paciente prenatal. Las técnicas actuales para la amplificación genómica in vitro implican protocolos laboriosos de clonación y cultivo que han limitado la utilidad de la secuenciación genómica. Otras técnicas, tales como la PCR, aunque rápidas y fiables, no son capaces de amplificar un genoma de una manera representativa.

Aunque la PCR con cebadores aleatorios puede manipularse fácilmente para amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos en una reacción, este método no resulta preferente debido a que la biblioteca amplificada no es representativa de la biblioteca de partida. Es decir, en el contexto de una PCR aleatoria algunas secuencias de ADN se amplifican preferentemente a expensas de otras secuencias, de manera que el producto amplificado no representa el material de partida. Este problema de la PCR puede superarse si cada miembro individual de una biblioteca se amplifica en una reacción separada. Sin embargo, este enfoque puede no resultar práctico en el caso de que se requieran muchos miles de tubos de reacción para el procedimiento de amplificación, ya que una biblioteca genómica o una biblioteca de ADNc puede incluir más de 100.000 fragmentos. La amplificación individual de cada fragmento de estas bibliotecas en una reacción separada no resulta práctica.

El documento WO 00/40712 da a conocer un método de separación óptica utilizado para aislar uno o más elementos genéticos codificantes de un producto génico que presente una actividad deseada.

Descripción resumida de la invención

La presente invención proporciona un método para amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos (por ejemplo cada secuencia de una biblioteca de ADN, transcriptoma o genoma) de una manera rápida y económico en un único tubo de reacción. Un uso del método de la invención es llevar a cabo la amplificación clonal simultánea (por ejemplo mediante PCR) de una pluralidad de muestras (hasta varios cientos de miles) en un recipiente de reacción. La presente invención proporciona además un medio para encapsular una pluralidad de muestras de ADN individualmente en una microcápsula de una emulsión (es decir, un microrreactor), llevando a cabo la amplificación de la pluralidad de muestras encapsuladas de ácidos nucleicos simultáneamente, y liberando dicha pluralidad amplificada de ADN de las microcápsulas para reacciones posteriores.

En una realización, se hibridan copias individuales de la especie de ácido nucleico molde a perlas de captura que comprenden, por ejemplo, oligonucleótidos de captura o grupos químicos que se unen al molde de ácidos nucleicos. Las perlas se suspenden en solución de amplificación completa (ver el Ejemplo 2 para un ejemplo de una solución de amplificación) y se emulsionan para producir microrreactores (típicamente de 100 a 200 micrómetros de diámetro). A continuación, se utiliza la amplificación asimétrica (por ejemplo la PCR) para incrementar clonalmente el número de copia de la especie molde inicial en los microrreactores, y estas copias se unen a las perlas de captura en los microrreactores.

En una realización alternativa, se añaden perlas de captura a una mezcla de reacción de amplificación (por ejemplo una solución de amplificación del Ejemplo 2) que comprende ácido nucleico molde y esta mezcla se emulsiona para producir microrreactores. Se utiliza la amplificación asimétrica (por ejemplo una PCR) para incrementar clonalmente el número de copia de la especie molde inicial en los microrreactores, y estas copias se unen a las perlas de captura en los microrreactores.

Una ventaja de la presente invención es que los microrreactores permiten la amplificación clonal y discreta simultánea de muchos moldes diferentes sin contaminación cruzada de los productos amplificados o reactivos, o el dominio de un molde particular o conjunto de moldes (por ejemplo el sesgo de PCR). La reacción de amplificación, por ejemplo, puede llevarse a cabo simultáneamente con por lo menos 3.000 microrreactores por microlitro de mezcla de reacción. Preferentemente, cada microrreactor comprende una o unas pocas especies de molde amplificado.

En diversas realizaciones de la invención, los microrreactores presentan un tamaño medio de entre aproximadamente 10 µm y aproximadamente 250 µm. En una realización preferente, los microrreactores presentan un diámetro medio de entre aproximadamente 60 y aproximadamente 200 µm. En una realización más preferente, los microrreactores presentan un diámetro medio de aproximadamente 60 µm, tal como una media de entre 40 µm y 80 µm de diámetro. En una realización, los microrreactores presentan un diámetro medio de aproximadamente 60 µm. En otra realización preferente, los microrreactores presentan un volumen medio de aproximadamente 113 pl. En una realización todavía más preferente, aproximadamente 3.000 microrreactores se encuentran contenidos en un microlitro de una emulsión 1:2 de agua en aceite.

La presente invención proporciona además un método para producir una pluralidad de perlas portadoras de ácidos nucleicos molde, en la que cada perla comprende hasta 1.000.000 copias o más de una única secuencia de ácidos nucleicos. En una realización preferente, cada perla puede comprender más de 20 millones de copias de un único ácido nucleico.

La presente invención proporciona además un método para enriquecer aquellas perlas que contengan el producto de la amplificación exitosa de ADN (es decir, mediante la eliminación de perlas que no presentan ADN unido a las mismas).

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 Esquema de la estructura de una perla de captura de ADN.

Figuras 2A-2B Esquema de una realización de un procedimiento de amplificación en emulsión de perlas.

Figura 3 Esquema de un procedimiento de enriquecimiento para eliminar perlas que no presentan ningún ADN unido a las mismas.

Figura 4 Ilustración de dispositivo utilizado para sostener tubos en la placa de agitación situada bajo una bomba vertical de jeringa. El dispositivo se modificó para sostener tres conjuntos de mezclas de reacción de amplificación en emulsión de perlas. La jeringa se cargó con la mezcla de reacción de PCR y perlas.

Figura 5 Ilustración de la organización óptima de jeringas en una bomba vertical de jeringa y orientación de los tubos de emulsión bajo las salidas de las jeringas.

Figura 6 Ilustración de la organización óptima del bloque impulsor de la bomba de jeringas contra los émbolos de las jeringas, y orientación óptima del dispositivo sobre la placa de agitación. Mediante la utilización de dicha disposición, se expulsa el contenido de la jeringa en el aceite en emulsión bajo agitación.

Figura 7 Ilustración de perlas (ver las flechas) suspendidas en microrreactores individuales según los métodos de la invención.

Figura 8A-8C Esquema que muestra las etapas iniciales de amplificación en emulsión de perlas utilizada conjuntamente con la secuenciación desde dos extremos. La perla activada por NHS (figura 8A) se une a los cebadores de captura (figura 8B) y se encapsula en un microrreactor que comprende la perla de captura de ADN y molde (figura 8C).

Figura 9 Esquema que muestra las etapas de amplificación y de captura de la amplificación en emulsión...

1. Método para la amplificación de uno o más ácidos nucleicos sobre una perla, que comprende las etapas siguientes:

2. Método según la reivindicación 1, en el que una mayoría de los microrreactores incluye un único ácido nucleico.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha solución de reacción de amplificación es una solución de reacción en cadena de polimerasa que comprende además nucleótidos trifosfato, una polimerasa termoestable, y tampón compatible con las condiciones de reacción en cadena de polimerasa.

4. Método según la reivindicación 1, en el que dicha emulsión contiene además estabilizantes de emulsión.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dichos estabilizantes de emulsión se seleccionan de entre el grupo que consiste de Atlox 4912, Span 80 y combinaciones y mezclas de los mismos.

6. Método según la reivindicación 1, en el que dicha emulsión es termoestable.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicha emulsión es termoestable hasta 95ºC.

8. Método según la reivindicación 1, en el que la amplificación se lleva a cabo mediante un método seleccionado de entre el grupo que consiste de amplificación basada en la transcripción, amplificación rápida de extremos del ADNc, amplificación en flujo continuo y amplificación de círculo rodante.

9. Método según la reivindicación 1, en el que la emulsión se forma mediante la adición gota a gota de los ácidos nucleicos molde, perlas y solución de reacción de amplificación en un aceite.

10. Método según la reivindicación 1, puesto en práctica con por lo menos 10.000 ácidos nucleicos.

11. Método según la reivindicación 1, puesto en práctica con por lo menos 50.000 ácidos nucleicos.

12. Método según la reivindicación 1, en el que los microrreactores presentan un tamaño medio comprendido entre 50 y 250 µm de diámetro.

13. Método según la reivindicación 1, en el que cada perla se una a más de 10.000 copias amplificadas asimétricamente del ácido nucleico molde monocatenario.

14. Método para la amplificación de un ácido nucleico, que comprende las etapas siguientes:

15. Método según la reivindicación 1 ó 14, que comprende además la etapa de enriquecer en perlas que se unen a copias amplificadas del ácido nucleico respecto a perlas a las que no se une ningún ácido nucleico, seleccionando la etapa de enriquecimiento de entre el grupo que consiste de purificación por afinidad, electroforesis y separación celular.

16. Método según la reivindicación 15, en el que la etapa de enriquecimiento se lleva a cabo mediante purificación por afinidad con perlas magnéticas que se unen a ácidos nucleicos.

17. Método según la reivindicación 1 ó 14, en el que se unen a cada perla por lo menos 100.000 copias de cada molécula de ácido nucleico diana.

18. Método según la reivindicación 1 ó 14, en el que se unen a cada perla por lo menos 1.000.000 copias de cada molécula de ácido nucleico diana.

19. Método según la reivindicación 1 ó 14, en el que se unen a cada perla por lo menos 1 a 20.000.000 copias de cada molécula de ácido nucleico diana.

20. Método según la reivindicación 1 ó 14, en el que las perlas son perlas de sefarosa.

21. Método según la reivindicación 16, que comprende además las etapas siguientes:

22. Método según la reivindicación 21, en el que la separación se lleva a cabo mediante incubación a una temperatura superior a 45ºC o mediante la incubación de las perlas portadoras de molde y las perlas magnéticas en una solución con un pH básico.

23. Método para la producción de una población clonal de ácidos nucleicos, que comprende:

24. Método según la reivindicación 23, que comprende además transcribir y traducir los ácidos nucleicos para generar por lo menos 10.000 copias de un producto de expresión.

25. Método según la reivindicación 24, en el que dicho producto de expresión se encuentra unido a dichas perlas mediante una pareja de unión seleccionada de entre el grupo que consiste de las parejas de unión antígeno/anticuerpo, ligando/receptor, 6Xhis/níquel-ácido nitriloacético y etiqueta FLAG/anticuerpo de FLAG.

26. Método según la reivindicación 24, en el que el método produce una población clonal de proteínas.

27. Método según la reivindicación 26, en el que las proteínas se seleccionan de entre el grupo que consiste de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y anticuerpos manipulados.

28. Método según la reivindicación 1 ó 14, en el que el método comprende además las etapas siguientes:

29. Método según la reivindicación 1 ó 14, en el que, en la etapa (b) o (d), respectivamente, la solución de reacción se encuentra empobrecida en moléculas de la segunda población de la primera especie de cebador.