Un método para identificar compuestos candidatos para mejorar la función de vía de CREB que comprende las operaciones de:

a) poner en contacto células anfitrionas que comprenden un gen indicador enlazado operativamente a un promotor de CRE con un compuesto de ensayo y con una dosis subóptima de un agente estimulante de la función de CREB; b) determinar la actividad del indicador en células anfitrionas que han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo y con dicho agente estimulante de la función de CREB; c) comparar la actividad del indicador determinada en la operación b) con la actividad del indicador en células de control que han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo; d) seleccionar dicho compuesto de ensayo si: i) la actividad del indicador determinada en la operación b) ha aumentado con relación a la actividad del indicador en dichas células de control que han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo; y ii) la actividad del indicador en células de control que no han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que han sido puestas en contacto con el compuesto de ensayo no es diferente significativamente con relación a la actividad del indicador en células de control que no han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo; e) repetir las operaciones a) a d) con una gama o variedad de concentraciones diferentes de dicho compuesto de ensayo seleccionado en la operación d); y f) seleccionar dicho compuesto de ensayo si: i) la actividad del indicador ha aumentado en la gama de concentraciones diferentes para dicho compuesto de ensayo con relación a la actividad del indicador en dichas células de control que han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo; y ii) la actividad del indicador en células de control que no han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y en las que ha sido introducida dicha gama de concentraciones diferentes de dicho compuesto de ensayo no es significativamente diferente con relación a la actividad del indicador en células de control que no han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo, en el que dicho compuesto de ensayo es identificado como un compuesto candidato para mejorar la función de vía de CREB, opcionalmente en el que dichas células anfitrionas son puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo antes de hacer contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB

Métodos de escrutinio para potenciadores cognitivos.

Antecedentes del invento

Un número estimado de 4 a 5 millones de norteamericanos (aproximadamente el 2% de todas las edades y el 15% de los mayores de 65) tienen alguna forma o grado de fallo cognitivo o cognoscitivo. El fallo cognitivo (disfunción o pérdida de funciones cognitivas, el proceso por el que el conocimiento es adquirido, retenido y usado) ocurre corrientemente en asociación con desórdenes o condiciones del sistema nervioso central (CNS), incluyendo discapacidades de la memoria asociadas con la edad, delirio (algunas veces denominado estado de confusión aguda), demencia (algunas veces clasificada como de tipo Alzheimer o de tipo no Alzheimer), enfermedad de Alzheimer, síndrome de Parkinson, enfermedad de Huntington (baile de San Vito o "corea"), enfermedad cerebrovascular (por ejemplo, ictus o derrame cerebral, isquemia), desórdenes afectivos (por ejemplo, depresión), desórdenes sicóticos (por ejemplo, esquizofrenia, autismo (Síndrome de Kanner)), desórdenes neuróticos (por ejemplo, ansiedad, desorden obsesivo-compulsivo), desorden de falta de atención (ADD), hematoma subdural, hidrocefalia de presión normal, tumor cerebral o traumatismo cerebral.

La disfunción cognitiva se manifiesta típicamente por uno o más déficit cognitivos, que incluyen discapacidad de la memoria (discapacidad para aprender nueva información o para recordar información aprendida previamente), afasia (perturbación del lenguaje/capacidad para hablar), apraxia (discapacidad para llevar a cabo actividades motrices a pesar de que la función motriz esté intacta), agnosia (fallo para reconocer o identificar objetos a pesar de que la función sensorial esté intacta), perturbación en funciones ejecutivas (es decir, planificar, organizar, ordenar secuencialmente, abstraer).

La disfunción cognitiva causa discapacidades significativas de funcionamiento social y/o ocupacional, que pueden interferir con la capacidad de un individuo para realizar actividades de la vida diaria y afectan gravemente a la autonomía y calidad de vida del individuo. Así, hay un interés considerable en identificar candidatos clínicos para usar en la rehabilitación de un animal con cualquier forma de disfunción cognitiva.

Sumario del invento

El presente invento se refiere a métodos (ensayos) basados en células de alto rendimiento para identificar o explorar (seleccionar) detenidamente potenciadores cognitivos que actúan aumentando la función de la vía de CREB. El invento permite la identificación de potenciadores cognitivos que tienen poco o ningún efecto sobre la función de la vía de CREB sola, pero que actúan para aumentar (mejorar) la función de la vía de CREB en combinación con un agente que estimula la función de CREB. Los potenciadores cognitivos identificados de acuerdo con el invento se espera que produzcan candidatos clínicos efectivos para usar en la rehabilitación de un animal con disfunciones cognitivas y para usar en la mejora de la memoria o del rendimiento (capacidad o función) cognitivo normal en un animal normal. Los "potenciadores cognitivos" son también denominados aquí como "compuestos capaces de mejorar la función de la vía de CREB" y "fármacos que mejoran la vía de CREB". Los "agentes estimulantes de la función de CREB" son también denominados aquí como "agentes que estimulan la función de la vía de CREB". Se ha comprendido que, en ciertos casos, un potenciador cognitivo identificado de acuerdo con el presente invento puede ser un agente estimulante de la función de CREB. Así, un agente estimulante de la función de CREB puede ser identificado como un potenciador cognitivo que usa los métodos descritos aquí.

Como se ha descrito aquí, los métodos para identificar o explorar detenidamente potenciadores cognitivos comprenden una exploración primaria, una exploración secundaria y una exploración terciaria. Preferiblemente, la exploración primaria es un método basado en células usado para identificar compuestos candidatos; la exploración secundaria es un método basado en células usado para identificar compuestos candidatos confirmados; y la exploración terciaria usa un modelo de comportamiento para identificar potenciadores cognitivos.

La exploración primaria comprende: (a) poner en contacto células anfitrionas (particularmente células de origen neural (por ejemplo, neuroblastomas, células madre neurales) que comprenden un gen indicador enlazado operativamente con un promotor de CRE con un compuesto de ensayo y con una dosis subóptima de un agente estimulante de la función de CREB (por ejemplo, forskolina); (b) determinar la actividad del indicador en células anfitrionas que han sido puestas en contacto con el compuesto de ensayo y con el agente estimulante de la función de CREB; (c) comparar la actividad del indicador determinada en la operación (b) con la actividad del indicador en células de control que han sido puestas en contacto con el agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con el compuesto de ensayo (es decir, células de control que han sido puestas en contacto solamente con el agente estimulante de la función de CREB); (d) seleccionar el compuesto de ensayo si (1) la actividad del indicador determinada en la operación (b) ha aumentado de modo significativo estadísticamente con relación a la actividad del indicador en las células de control de la operación (c); y (2) la actividad del indicador en células de control que no han sido puestas en contacto con el agente estimulante de la función de CREB y que han sido puestas en contacto con el compuesto de ensayo (es decir, células de control que han sido puestas en contacto sólo con el compuesto de ensayo) no es diferente de modo significativo estadísticamente con relación a la actividad del indicador en células de control que no han sido puestas en contacto ni con el agente estimulante de la función de CREB ni con el compuesto de ensayo (es decir, células de control que no han sido puestas en contacto con nada); (e) repetir las operaciones (a) a (d) con una gama o variedad de concentraciones diferentes (por ejemplo, 2 o más) del compuesto de ensayo seleccionado en la operación (d); y (f) seleccionar el compuesto de ensayo si: (1) la actividad del indicador ha aumentado de modo significativo estadísticamente de modo proporcional en la gama de concentraciones diferentes para dicho compuesto de ensayo con relación a la actividad del indicador en las células de control que han sido puestas en contacto sólo con el agente estimulante de la función de CREB; y (2) la actividad del indicador en células de control a la que ha sido introducida la gama de concentraciones diferentes del compuesto de ensayo control no es significativamente diferente con relación a la actividad del indicador en células de control que no han sido puestas en contacto ni con el agente estimulante de la función de CREB ni con el compuesto de ensayo, en el que el compuesto de ensayo es identificado como un compuesto candidato. En una realización particular, las células anfitrionas son puestas en contacto con el compuesto de ensayo antes del contacto con el agente estimulante de la función de CREB. En otra realización, el gen indicador codifica luciferasa. Un gen indicador enlazado operativamente con un promotor de CRE es denominado también como un gen indicador mediado por CREB. Un gen indicador mediado por CREB es un ejemplo de un transgen mediado por CREB.

Alternativamente, la exploración primaria comprende: (a) poner en contacto células anfitrionas (particularmente células de origen neural (por ejemplo, neuroblastomas, células madre neurales) con un compuesto de ensayo y con una dosis subóptima de un agente estimulante de la función de CREB (por ejemplo, forskolina); (b) evaluar la expresión de gen endógeno dependiente de CREB en las células anfitrionas que han sido puestas en contacto con el compuesto de ensayo y con el agente estimulante de la función de CREB; (c) comparar la expresión de gen endógeno dependiente de CREB evaluada en la operación (b) con la expresión de gen endógeno dependiente de CREB en células de control que han sido puestas en contacto con el agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con el compuesto de ensayo (es decir, células de control que han sido puestas en contacto solo con el agente estimulante de la función de CREB); (d) seleccionar el compuesto de ensayo si (1) la expresión de gen endógeno dependiente de CREB determinada en la operación (b) ha aumentado de modo significativo estadísticamente con relación a la expresión de gen endógeno dependiente de CREB en las células de control de la operación...

1. Un método para identificar compuestos candidatos para mejorar la función de vía de CREB que comprende las operaciones de: a) poner en contacto células anfitrionas que comprenden un gen indicador enlazado operativamente a un promotor de CRE con un compuesto de ensayo y con una dosis subóptima de un agente estimulante de la función de CREB; b) determinar la actividad del indicador en células anfitrionas que han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo y con dicho agente estimulante de la función de CREB; c) comparar la actividad del indicador determinada en la operación b) con la actividad del indicador en células de control que han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo; d) seleccionar dicho compuesto de ensayo si: i) la actividad del indicador determinada en la operación b) ha aumentado con relación a la actividad del indicador en dichas células de control que han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo; y ii) la actividad del indicador en células de control que no han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que han sido puestas en contacto con el compuesto de ensayo no es diferente significativamente con relación a la actividad del indicador en células de control que no han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo; e) repetir las operaciones a) a d) con una gama o variedad de concentraciones diferentes de dicho compuesto de ensayo seleccionado en la operación d); y f) seleccionar dicho compuesto de ensayo si: i) la actividad del indicador ha aumentado en la gama de concentraciones diferentes para dicho compuesto de ensayo con relación a la actividad del indicador en dichas células de control que han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo; y ii) la actividad del indicador en células de control que no han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y en las que ha sido introducida dicha gama de concentraciones diferentes de dicho compuesto de ensayo no es significativamente diferente con relación a la actividad del indicador en células de control que no han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo, en el que dicho compuesto de ensayo es identificado como un compuesto candidato para mejorar la función de vía de CREB, opcionalmente en el que dichas células anfitrionas son puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo antes de hacer contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB.

2. El método según la reivindicación 1ª, en el que a) dichas células anfitrionas son células de neuroblastoma humanas; y/o b) dicho gen indicador codifica luciferasa; y/o c) dicho agente estimulante de la función de CREB es forskolina.

3. El método según la reivindicación 1ª o 2ª en el que las operaciones a) a d) son repetidas con una gama de cuatro concentraciones diferentes de dicho compuesto de ensayo seleccionado en la operación d).

4. El método según la reivindicación 1ª, que comprende además las operaciones de: g) poner en contacto células de origen neural con dicho compuesto candidato y con una dosis subóptima de un agente estimulante de la función de CREB, en el que dichas células de origen neural son diferentes de las células anfitrionas de la operación a); h) evaluar la expresión de gen endógeno dependiente de CREB en dichas células que han sido puestas en contacto con dicho compuesto candidato y con dicho agente estimulante de la función de CREB; y i) comparar la expresión de gen endógeno dependiente de CREB evaluada en la operación h) con la expresión de gen endógeno dependiente de CREB en células de control que han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto candidato, en el que una diferencia en la expresión de gen dependiente de CREB evaluada en la operación h) comparada con la expresión de gen dependiente de CREB en células de control confirma que dicho compuesto es un compuesto candidato para mejorar la función de vía de CREB, identificando por ello dicho compuesto candidato como un compuesto candidato confirmado, opcionalmente en el que dichas células de origen neural son puestas en contacto con dicho compuesto candidato antes de hacer contacto con el agente estimulante de la función de CREB.

5. El método según la reivindicación 4ª, en el que (a) dichas células de origen neural son neuronas, opcionalmente en el que dichas neuronas son células primarias del hipocampo; y/o (b) dicho agente estimulante de la función de la vía CREB es forskolina.

6. Un método para evaluar el efecto de un compuesto candidato sobre la expresión de gen dependiente de CREB para mejorar la función de vía de CREB que comprende las operaciones de: a) poner en contacto células de origen neural con un compuesto candidato y con una dosis subóptima de un agente estimulante de la función de CREB; b) evaluar la expresión de gen endógeno dependiente de CREB en las células que han sido puestas en contacto con dicho compuesto candidato y con dicho agente estimulante de la función de CREB; y c) comparar la expresión de gen endógeno dependiente de CREB evaluada en la operación b) con la expresión de gen endógeno dependiente de CREB en células de control que han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto candidato, opcionalmente en el que dichas células de origen neural son puestas en contacto con dicho compuesto candidato antes de hacer contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB.

7. El método según la reivindicación 6ª, en el que: (a) dichas células de origen neural son neuronas, opcionalmente en que dichas neuronas son células primarias del hipocampo; y/o (b) dicho agente estimulante de la función de la vía CREB es forskolina.

8. Un método para explorar detenidamente un compuesto para su capacidad de mejorar la función de vía de CREB que comprende las operaciones de: a) poner en contacto células anfitrionas que comprenden un gen indicador enlazado operativamente a un promotor de CRE con un compuesto de ensayo, produciendo por ello una muestra de ensayo; b) poner en contacto la muestra de ensayo producida en la operación a) con una dosis subóptima de un agente estimulante de la función de CREB; c) determinar la actividad del indicador en dichas células anfitrionas que han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo y con dicho agente estimulante de la función de CREB; (d) comparar la actividad del indicador determinada en la operación c) con la actividad del indicador en células de control que han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo; e) seleccionar dicho compuesto de ensayo si : 1) la actividad del indicador determinada en la operación c) ha aumentado con relación a la actividad del indicador en dichas células de control que han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo; y 2) la actividad del indicador en dichas células de control que no han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo no es significativamente diferente con relación a la actividad del indicador en células de control que no han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo; f) repetir las operaciones a) a e) con una gama de diferentes concentraciones de dicho compuesto de ensayo seleccionado en la operación e); g) seleccionar dicho compuesto de ensayo si: 1) la actividad del indicador ha aumentado en la gama de concentraciones diferentes para dicho compuesto de ensayo con relación a la actividad del indicador en dichas células de control que han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo; y, 2) la actividad del indicador en células de control que no han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y en las que ha sido introducida dicha gama de concentraciones diferentes de dicho compuesto de ensayo no es significativamente diferente con relación a la actividad del indicador en células de control que no han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de vía de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto de ensayo, seleccionando por ello un compuesto candidato; h) poner en contacto células de origen neural con dicho compuesto candidato seleccionado en la operación g) y con una dosis subóptima de un agente estimulante de la función de CREB; i) evaluar la expresión de gen endógeno dependiente de CREB en las células que han sido puestas en contacto con dicho compuesto candidato y con dicho agente estimulante de la función de CREB; j) comparar la expresión de gen endógeno dependiente de CREB evaluada en la operación i) con la expresión de gen endógeno dependiente de CREB en células de control que han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto candidato; k) seleccionar dicho compuesto candidato si: 1) la expresión de gen endógeno dependiente de CREB evaluada en la operación i) ha aumentado con relación a la expresión de gen endógeno dependiente de CREB en células de control que han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto candidato; y 2) la expresión de gen endógeno dependiente de CREB en células de control que no han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que han sido puestas en contacto con dicho compuesto candidato no es significativamente diferente con relación a la expresión de gen endógeno dependiente de CREB en células de control que no han sido puestas en contacto con dicho agente estimulante de la función de CREB y que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto candidato, seleccionando por ello un compuesto candidato confirmado; l) administrar dicho compuesto candidato confirmado seleccionado en la operación k) a un animal no humano (por ejemplo un mamífero); m) entrenar a dicho animal al que se le ha administrado dicho compuesto candidato confirmado en condiciones apropiadas para producir una formación de memoria a largo plazo en dicho animal; n) evaluar la formación de memoria a largo plazo en dicho animal entrenado en la operación m); y o) comparar la formación de memoria a largo plazo evaluada en la operación n) con dicha formación de memoria a largo plazo producida en el animal de control al que no se le ha administrado dicho compuesto candidato confirmado.

9. El método según la reivindicación 8ª, en el que dichas células anfitrionas son células de neuroblastoma humanas y dichas células de origen neural son neuronas, opcionalmente en las que dichas neuronas son células primarias del hipocampo; y/o b) dicho gen indicador codifica luciferasa; y/o c) dicho agente estimulante de la función de CREB es forskolina.

10. El método según la reivindicación 8ª o 9ª en el que las operaciones a) a e) son repetidas con una gama de cuatro concentraciones diferentes de dicho compuesto de ensayo seleccionado en la operación e).