Utilización de anticuerpos anti-aminofosfolípidos para el tratamiento del cáncer.

Una composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de un anticuerpo antiaminofosfolípido o de una región de unión al antígeno del mismo,

para el tratamiento del cáncer para el tratamiento del cáncer por exterminio de células endoteliales vasculares de un tumor de un tumor vascularizado, que induce la coagulación en la vasculatura tumoral o que destruye la vasculatura tumoral.

Utilización de anticuerpos anti-aminofosfolípidos para el tratamiento del cáncer

Antecedentes de la invención 1. Sector técnico al que pertenece la invención La presente invención hace referencia en general a los vasos sanguíneos y a la biología de los tumores. Más particularmente, abarca los descubrimientos sorprendentes de que los aminofosfolípidos, tales como la fosfatidilserina y la fosfatidiletanolamina, son marcadores específicos y estables de vasos sanguíneos de tumores y que la administración de anticuerpos anti-aminofosfolípidos solos es suficiente para inducir trombosis y regresión del tumor. La invención proporciona, por lo tanto, métodos y compuestos seguros y eficaces para el ataque específico y destrucción de vasos sanguíneos de tumores y para el tratamiento de tumores sólidos. La utilización de anticuerpos no conjugados anti-fosfatidilserina es una ventaja específica, si bien la invención proporciona diferentes compuestos eficaces y combinaciones de losmismos.

2. Descripción de las técnicas relacionadas La resistencia de las células de los tumores a los agentes quimioterapéuticos representa un problema significativo en la oncología clínica. De hecho, ésta es una de las principales razones por las que muchas de las formas más prevalecientes de cáncer humano todavía resisten la intervención quimioterapéutica efectiva, a pesar de ciertos avances en el campo dela quimioterapia.

Un problema significativo que se presenta en los regímenes de tratamiento de tumores es el deseo de una eliminación total celular. Esto significa que los regímenes de tratamiento más efectivos se acercan más a una eliminación de células total de todas las células malignas conocidas como clonogénicas, es decir, células que tienen la capacidad para crecer incontroladas y reemplazar cualquier masa de tumor que podría haber sido eliminada por la terapia. Debido a la meta de desarrollar tratamientos que se acerquen a una eliminación de células total, ciertos tipos de tumores han sido más dóciles a la terapia que otros. Por ejemplo, los tumores de tejidos blandos, por ejemplo, linfomas, y los tumores de la sangre y de los órganos que forman la sangre, por ejemplo, leucemias, generalmente han respondido mejor a la terapia de quimioterapia que los tumores sólidos tales como los carcinomas.

Una razón para la susceptibilidad de los tumores blandos y basados en sangre para la quimioterapia es la mayor accesibilidad del linfoma y de las células leucémicas a la intervención quimioterapéutica. Simplemente, es mucho más difícil para la mayoría de las sustancias o agentes quimioterapéuticos alcanzar todas las células de una masa de tumor sólido de lo que es alcanzar los tumores blandos y los tumores basados en sangre, y por lo tanto mucho más difícil lograr una eliminación total de células. El aumentar la dosis de agentes quimioterapéuticos frecuentemente da como resultado efectos secundarios tóxicos, que generalmente limitan la efectividad de los agentes antitumorales convencionales.

Otra estrategia de tratamiento de tumores es el uso de una inmunotoxina, en la cual se usa un anticuerpo de células antitumoral para administrar toxina a las células del tumor. Sin embargo, en común con los enfoques quimioterapéuticos descritos anteriormente, la terapia de inmunotoxinas también padece algunas desventajas significativas. Por ejemplo, las células antígeno-negativas o deficientes de antígeno pueden sobrevivir y volver a poblar el tumor o conducir a otras metástasis. También, en el tratamiento de tumores sólidos, la masa del tumor generalmente es impermeable a moléculas del tamaño de anticuerpos e inmunotoxinas. Tanto las distancias de difusión física como la presión intersticial dentro del tumor son limitaciones significativas a este tipo deterapia.

Una estrategia más reciente ha sido la de atacar la vasculatura de los tumores sólidos. Al tener como objetivo los vasos sanguíneos de los tumores, en vez de las mismas células de los tumores, tiene ciertas ventajas porque no es probable que ello conduzca al desarrollo de células detumor resistentes, y porque las células objetivo son fácilmente accesibles. Más aún, la destrucción de los vasos sanguíneos conduce a la amplificación del efecto antitumor, ya que muchas células de los tumores dependen de un solo vaso para su oxígeno y nutrientes (Denekamp, 1990) . Se describen estrategias de ataque vascular efectivas en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5.855.866 y 5.965.132, que particularmente describen la administración dirigida de agentes anticelulares y toxinas a la vasculatura delos tumores.

Otra versión efectiva del enfoque del ataque vascular es dirigir un factor de coagulación a la vasculatura del tumor (Huang y otros, 1997; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica números 5.877.289, 6.004.555 y 6.093.399. La utilización de anticuerpos y otros agentes de direccionado para suministrar coagulantes a la vasculatura de tumores tiene las ventajas adicionales de inmunogenicidad reducida e incluso un riesgo más bajo de efectos secundarios tóxicos. Como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5.877.289, un factor de coagulación preferente para su uso en estos trombógenos específicos de tumores, o coaguligandos, es una versión truncada de la proteína que induce a la coagulación humana, el factor de tejido (TF) . El factor de tejido (TF) es el iniciador más importante de la coagulación de la sangre (Ruf y otros, 1991; Edgington y otros, 1991; Ruf y Edgington, 1994) . El tratamiento de ratones que tienen tumores con estos coaguligandos da como resultado una

necrosis significativa del tumor e incluso la regresión completa del tumor en muchos animales (Huang y otros, 1997; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5.877.289, 6.004.555 y 6.093.399) .

Fishman y otros, Int. J. Oncol., Vol. 10, p901-904 (1997) se refieren al posible ataque de células cancerígenas, utilizando anticuerpos producidos en enfermedades autoinmunes.

Aunque la administración específica de agentes terapéuticos, tales como los agentes anticelulares, toxinas y factores de coagulación, a los vasos del tumor representa un avance significativo en los protocolos de tratamiento de tumor, todavía hay lugar para terapias de ataque vascular adicionales o incluso alternativas. La identificación de objetivos adicionales para permitir la destrucción de los vasos de tumores específicos in vivo naturalmente sería beneficioso al extender el número de opciones objetivo. Más particularmente, tal como en los constructos de ataque vascular anteriormente descritos y coaguligandos, se dispone de sistemas de dos componentes que comportan el agente de ataque y la parte efectiva, el desarrollo de un agente componente para la destrucción de la vasculatura del tumor representaría un progreso importante. En caso de que la preparación de este tipo de agentes se demostrara posible, ello aceleraría también probablemente el progreso de la terapia anti-vascular para el ámbito clínico, dadala simplicidad del nuevo agente terapéutico.

La presente invención se propone resolver las carencias de la técnica anterior al dar a conocer una nueva utilización de un anticuerpo o antígeno anti-aminofosfolípido que une un fragmento del mismo para la destrucción específica del tumor. La invención se basa en parte en el descubrimiento de que los aminofosfolípidos, tales como la fosfatidilserina y la fosfatidiletanolamina, son marcadores accesibles y utilizables de manera estable de los vasos de los tumores. Más particularmente, la invención incorpora el sorprendente descubrimiento de que los anticuerpos desnudos contra componentes aminofosfolípidos son capaces de inducir específicamente destrucción de los vasos sanguíneos de los tumores y necrosis delos tumores in vivo.

En un primer aspecto de la presente invención se proporciona una composición que comprende una cantidad biológicamente efiectiva de un anticuerpo anti-aminofosfolípido o región de unión al antígeno del mismo, para el tratamiento del cáncer por exterminio de las células endoteliales vasculares tumorales de un tumor vascularizado, que induce la coagulación en la vasculatura tumoral o que destruye la vasculatura tumoral.

Como característica sorprendente que subyace en la invención se puede indicar la translocación de aminofosfolípidos, tales como PS, a las células endoteliales vasculares de la superficie del tumor tiene lugar, como mínimo de una manera significativa, con independencia de los daños en las células o de los mecanismos apoptóticos u otros de muerte celular. Por lo tanto, la expresión superficial PS en el medio del tumor no es una consecuencia de la muerte y destrucción... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva de un anticuerpo antiaminofosfolípido o de una región de unión al antígeno del mismo, para el tratamiento del cáncer para el tratamiento del cáncer por exterminio de células endoteliales vasculares de un tumor de un tumor vascularizado, que induce la coagulación en la vasculatura tumoral o que destruye la vasculatura tumoral.

2. La composición para uso según la reivindicación 1, en la que dicho anticuerpo anti-aminofosfolípido o región de unión al antígeno del mismo se une a un complejo amonifosfolípido proteína en la superficie luminal de los vasos sanguíneos de un tumor vascularizado.

3. La composición para uso según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha composición comprende un anticuerpo anti-aminofosfolípido IgG o IgM o una región de unión al antígeno del mismo.

4. La composición para uso según la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que dicha composición comprende un anticuerpo anti-aminofosfolípido IgG.

5. La composición para uso según la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que dicha composición comprende un fragmento de unión a antígeno scFv, Fv, Fab', Fab o F (ab') 2 de un anticuerpo anti-aminofosfolípido.

6. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición comprende un anticuerpo anti-aminofosfolípido monoclonal, o una región de unión al antígeno del mismo.

7. La composición para uso según la reivindicación 6, en la que dicho anticuerpo anti-aminofosfolípido monoclonal, o fragmento de unión al antígeno del mismo, se prepara mediante un proceso de preparación que comprende;

(a) preparar una célula que produce un anticuerpo anti-aminofosfolípido; y

(b) obtener un anticuerpo anti-aminofosfolípido monoclonal a partir de dicha célula que produce el anticuerpo.

8. La composición para uso según la reivindicación 7, en la que dicha célula que produce un anticuerpo antiaminofosfolípido es una célula de paciente humano, en donde dicho paciente tiene una enfermedad asociada con la producción de anticuerpos anti-aminofosfolípidos.

9. La composición para uso según la reivindicación 7, en la que dicha célula que produce un anticuerpo antiaminofosfolípido se obtiene mediante la estimulación in vitro de una población mezclada de linfocitos de sangre periférica humana con una cantidad inmunogénicámente efectiva de una muestra de aminofosfolípido.

10. La composición para uso según la reivindicación 7, en la que dicha célula que produce un anticuerpo antiaminofosfolípido se obtiene inmunizando un animal no humano con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido.

11. La composición para uso según la reivindicación 10, en la que dicha célula que produce anticuerpo antiaminofosfolípido se obtiene inmunizando un ratón transgénico que comprende una biblioteca de anticuerpos humanos con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido.

12. La composición para uso según la reivindicación 7, en la que dicho proceso preparativo comprende:

(a) fusionar dicha célula que produce un anticuerpo anti-aminofosfolípido con una célula inmortal para preparar un hibridoma que produzca un anticuerpo anti-aminofosfolípidomonoclonal; y

(b) obtener dicho anticuerpo anti-aminofosfolípido monoclonal a partir de dicho hibridoma.

13. La composición para uso según la reivindicación 7, en la que dicho proceso preparativo comprende:

(a) inmunizar un animal no humano con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido;

(b) preparar una colección de hibridomas que producen anticuerpos a partir del animal inmunizado;

(c) seleccionar de la colección un hibridoma que produce un anticuerpo anti-aminofosfolípido; y

(d) cultivar el hibridoma seleccionado para proporcionar dicho anticuerpo monoclonal antiaminofosfolípido.

14. La composición para uso según la reivindicación 13, en la que el animal inmunizado es un ratón transgénico que comprende una biblioteca de anticuerpos humanos y en el que dicho anticuerpo monoclonal antiaminofosfolípido es un anticuerpo monoclonal humano.

15. La composición para uso según la reivindicación 7, en la que dicho proceso preparativo comprende:

(a) obtener ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-aminofosfolípido a partir de dicha célula que

produce anticuerpo anti-aminofosfolípido; y

(b) expresar dichos ácidos nucleicos para obtener un anticuerpo anti-aminofosfolípido recombinante monoclonal.

16. La composición para uso según la reivindicación 7, en la que dicho proceso preparativo comprende:

(a) inmunizar un animal no humano con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido;

(b) preparar una biblioteca de fagémidos de inmunoglobulina combinatoria que expresa ARN aislado del bazo del animal inmunizado;

(c) seleccionar de la biblioteca de fagémidos un clon que expresa un anticuerpo anti-aminofosfolípido; y

(d) expresar los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-aminofosfolípido a partir de dicho clon seleccionado para proporcionar un anticuerpo monoclonal anti-aminofosfolípido recombinante.

17. La composición para uso según la reivindicación 16, en la que el animal inmunizado es un ratón transgénico que comprende una biblioteca de anticuerpos humanos y en la que el anticuerpo monoclonal anti-aminofosfolípido recombinante es un anticuerpo monoclonal recombinante humano.

18. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición comprende un anticuerpo anti-aminofosfolípido quimérico humano, humanizado o parte humano, o una región de unión al antígeno del mismo.

19. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición comprende un dímero, trímero o multímero de un anticuerpo anti-aminofosfolípido o fragmentos de unión al antígeno del mismo.

20. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición comprende un anticuerpo anti-aminofosfolípido o una región de unión al antígeno del mismo, que se une a fosfatidiletanolamina en la superficie luminal de vasos sanguíneos de un tumor vascularizado.

21. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición comprende un anticuerpo anti-aminofosfolípido o una región de unión al antígeno del mismo que se une a fosfatidilserina en la superficie luminal de los vasos sanguíneos de un tumor vascularizado.

22. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición comprende al menos dos anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno del mismo, cada uno de los cuales se une a un aminofosfolípido distinto.

23. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición comprende un anticuerpo anti-aminofosfolípido o una región de unión al antígeno del mismo, que se une a fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina o fosfatidaletanolamina.

24. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición comprende un anticuerpo anti-aminofosfolípido o una región de unión al antígeno del mismo, preparado mediante un proceso preparativo que comprende:

(a) la estimulación in vitro de una población mezclada de linfocitos de sangre periférica humana con una cantidad inmunogénicámente efectiva de una muestra de aminofosfolípido;

(b) inmunizar un animal no humano con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido;

(c) inmunizar un ratón transgénico que comprende una biblioteca de anticuerpos humanos con una cantidad inmunogénicamente efectiva de una muestra de aminofosfolípido;

(d) obtener y expresar un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-aminofosfolípido; o

(e) seleccionar y expresar un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-aminofosfolípido a partir de una biblioteca de fagémidos de inmunoglobulinas combinatorias que expresa ARN aislado del bazo de un animal no humano inmunizado con una cantidad efectiva de una muestra de aminofosfolípido.

25. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición comprende un anticuerpo anti-aminofosfolípido o una región de unión al antígeno que se une a complejos lípido-proteína en los que la parte lipídica del complejo es fosfatidilserina o fosfatyidiletanolamina y la parte proteica del complejo es uno cualquiera de β2–glicoproteína I, protrombina, quininógenos y precalicreína.

26. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición es para uso en la inducción de la vasculatura tumoral después de administración a dicho animal.

27. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición es para uso en la destrucción dela vasculatura tumoral después de administración a dicho animal.

28. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición está formulada para administración intravenosa.

29. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición está formulada como una formulación liposomal.

30. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición está destinada para administración humana.

31. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición es para uso en combinación con una cantidad efectiva desde un punto de vista diagnóstico de un anticuerpo marcado de forma detectable o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a un aminofosfolípido.

32. La composición para uso según la reivindicación 31, en la que dicho anticuerpo marcado de forma detectable

o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende el compuesto detectable por rayos X bismuto (III) , oro (III) , lantano (III) o plomo (II) .

33. La composición para uso según la reivindicación 31, en la que dicho anticuerpo marcado de forma detectable o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende el ión radioactivo detectable cobre67, galio67, galio68, indio111, indio113, yodo123, yodo125, yodo131, mercurio197, mercurio203, renio186, renio188, rubidio97, rubidio103, tecnetio99m o itrio90.

34. La composición para uso según la reivindicación 31, en la que dicho anticuerpo marcado de forma detectable o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende el isótopo detectable por resonancia de espín magnética nuclear cobalto (II) , cobre (II) , cromo (III) , disprosio (III) , erbio (III) , gadolinio (III) ; holmio (III) , hierro (II) , hierro (III) , manganeso (II) ; neodimio (III) , níquel (II) , samario (III) , terbio (III) , vanadio (II) o iterbio (III) .

35. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición es para uso en combinación con una cantidad biológicamente efectiva de un segundo agente anticanceroso.

36. La composición para uso según la reivindicación 35, en la que dicha composición y dicho segundo agente anticanceroso están comprendidos dentro de una única composiciónfarmacéutica.

37. La composición para uso según la reivindicación 35, en la que dicha composición y dicho segundo agente anticanceroso están comprendidos dentro de composiciones farmacéuticas distintas.

38. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, en la que dicho segundo agente anticanceroso es un agente quimioterapéutico, radioterapéutico, anti-angiogénico o inductor de apoptosis.

39. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, en la que dicho segundo agente anticanceroso es un constructo de agente terapéutico-anticuerpo que comprende un anticuerpo de direccionado, o un fragmento de unión al antígeno del mismo se une a un componente expresado superficialmente, accesible superficialmente o localizado superficialmente de una célula tumoral, estroma tumoral o vasculatura tumoral; dicho anticuerpo de direccionado o fragmento del mismo enlazado operativamente a un agente terapéutico.

40. La composición para uso según la reivindicación 39, en la que dicho anticuerpo de direccionado o fragmento de unión al antígeno del mismo se une a un antígeno superficial celular de una célula tumoral o a un componente de un estroma tumoral.

41. La composición para uso según la reivindicación 39, en la que dicho anticuerpo de direccionado o fragmento de unión al antígeno del mismo, se une a un componente expresado superficialmente, accesible superficialmente,

localizado superficialmente, inducible por citoquina o inducible por coagulante de vasos sanguíneos intratumorales de un tumor vascularizado.

42. La composición para uso según la reivindicación 41, en la que dicho anticuerpo de direccionado o fragmento de unión al antígeno del mismo se une a un componente expresado superficialmente de vasculatura intratumoral seleccionado del grupo que consiste en un aminofosfolípido, endoglina, un receptor TGFβ, E-selectina, P-selectina, VCAM-1, ICAM-1, PSMA, un receptor VEGF/VPF, un receptor FGF, un TIE, αvβ3 integrina, pleyotropina, endosialina y una proteína MHC Clase II.

43. La composición para uso según la reivindicación 41, en la que dicho anticuerpo de direccionado o fragmento de unión al antígeno del mismo se une a un componente localizado superficialmente de vasculatura intratumoral seleccionado del grupo que consiste en VEGF/VPF, FGF, TGFβ, un ligando que se une a un TIE, a una isoforma de fibronectina asociada a tumor, factor de crecimiento disperso/hepatocito (HGF) , factor de plaquetas 4 (PF4) , PDGF y TIMP.

44. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 43, en la que dicho anticuerpo de direccionado o fragmento de unión al antígeno del mismo, está enlazado operativamente a un agente citotóxico.

45. La composición para uso según la reivindicación 44, en la que dicho anticuerpo de direccionado o fragmento de unión al antígeno del mismo está enlazado operativamente a una toxina derivada de planta, hongo o bacteria, en la que opcionalmente y preferiblemente la toxina es cadena de ricina A desglicosilada.

46. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 43, en la que dicho anticuerpo de direccionado o fragmento de unión al antígeno del mismo está enlazado operativamente a un factor de coagulación

o a un anticuerpo, o a un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une a un factor de coagulación.

47. La composición para uso según la reivindicación 46, en la que dicho anticuerpo de direccionado o fragmento de unión al antígeno del mismo está enlazado operativamente al Factor de Tejido, Factor de Tejido truncado, o un derivado de los mismos o a un anticuerpo o a un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une al Factor de tejido. Factor de Tejido truncado o a un derivado del mismo.

48. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, en la que dicho segundo agente anticanceroso es un agente seleccionado del grupo que consiste en taxol, vincristina, vinblastina, bleomicina, una combretastatina, una podofilotoxina, TNF-a, angiostatina, endostatina, vasculostatina, un antagonista αvβ3, una citoquina, interleuquina-4, H202, trombina, un compuesto que interfiere con la actividad de la tubulina, un agente inductor del flujo de calcio y un ionóforo de calcio.

49. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, en la que dicho segundo agente anticanceroso es un agente seleccionado del grupo que consiste en inhibidor de la fosfotirosina, un análogo de fosfotirosina no hidrolizable, un análogo de pirimidina, un análogo del ácido fólico, un complejo de coordinación de platino, un antiandrógeno y un análogo de la hormona de liberación de gonadotropina.

50. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, en la que dicho segundo agente anticanceroso es un agente seleccionado del grupo que consiste en talidomida, taxol, paclitaxel, 5-fluoracilo, camptotecina, cisplatino, carboplatino y leuprolida.