Composición que comprende un ARN(m) complejado y un ARNm desnudo para proporcionar o mejorar la respuesta inmunoestimuladora en un mamífero y usos de la misma.

Composición inmunoestimuladora que comprende

a) un componente adyuvante,

que comprende o consiste en al menos un ARN(m) complejado con un compuesto policatiónico que es un péptido o proteína policatiónico, como un primer componente, y

b) al menos un ARNm libre que codifica para al menos un antígeno, como un segundo componente,

donde la composición inmunoestimuladora es capaz de provocar o incrementar una respuesta inmune innata en un mamífero y donde la relación molar entre el ARN(m) del componente adyuvante a) y el al menos un ARNm libre del segundo componente b) está en el rango de 0,1:1 a 1:0,01

Composición que comprende un ARN (m) complejado y un ARNm desnudo para proporcionar o mejorar la respuesta inmunoestimuladora en un mamífero y usos de la misma.

La presente invención se refiere a una composición inmunoestimuladora que comprende a) un componente adyuvante, que comprende o consiste en al menos un ARN (m) complejado con un péptido policatiónico o una 5 proteína, y b) al menos un ARNm libre que codifica para al menos un antígeno, donde la composición inmunoestimuladora es capaz de desarrollar o mejorar una respuesta inmune innata y una respuesta inmune adaptiva en un mamífero. La composición inmunoestimuladora de la invención puede ser una composición farmacéutica o una vacuna. La invención se refiere además a un método para la preparación de la composición inmunoestimuladora de la invención. La invención también se refiere al uso de la composición inmunoestimuladora 10 de la invención (para la preparación de una composición farmacéutica o de una vacuna) para el tratamiento de varias enfermedades. Finalmente, la invención se refiere a kits que contienen la composición inmunoestimuladora de la invención, sus componentes y/o la composición farmacéutica o vacuna.

La inducción y/o mejora de las respuestas inmunes del sistema inmunológico innato y/o adaptivo juega un papel importante en el tratamiento y prevención de numerosas enfermedades. Para este propósito, el sistema 15 inmunológico es típicamente modulado, por ejemplo, por la administración de un agente inmunoestimulador o un adyuvante. Sin embargo, el sistema inmunológico de los vertebrados, tales como humanos, es muy complejo y finamente regulado. Consiste en muchos tipos de proteínas, células, órganos y tejidos, los cuales interactúan en una red elaborada y dinámica. El sistema inmunológico protege típicamente a estos organismos frente a infecciones con defensas estratificadas de especificidad cada vez más alta. Una capa de defensa comprende barreras físicas o 20 químicas y permite una eliminación a priori de al menos algunos patógenos y antígenos. Una capa adicional de defensa incluye el sistema inmunológico innato y adaptivo.

El sistema inmunológico innato, como parte del sistema inmunológico, es el sistema dominante de la defensa del huésped en la mayoría de los organismos y comprende barreras tales como barreras humorales y químicas, que incluyen, por ejemplo, inflamación, el sistema de complemento y barreras celulares. El sistema inmunológico innato 25 se basa típicamente en un pequeño número de receptores, llamados receptores de reconocimiento de patrón. Éstos reconocen patrones moleculares conservados que distinguen organismos extraños, como virus, bacterias, hongos y parásitos de las células de sus huéspedes. Estos patrones moleculares asociados a patógenos incluyen ácidos nucleicos virales, componentes las paredes bacterianas y fúngicas, proteínas flageladas, etc.

La primera familia de receptores de reconocimiento de patrón estudiada en detalle fue la familia del receptor tipo Toll 30 (TLR) . Los TLRs son proteínas transmembrana que reconocen ligandos del medio extracelular o del lumen de endosomas. Después de la unión al ligando, transducen la señal por medio de proteínas adaptoras citoplásmicas, lo cual lleva a activar una respuesta de defensa del huésped y a la consiguiente producción de péptidos antimicrobianos, quimioquinas y citoquinas proinflamatorias, citoquinas antivirales, etc. (véase, por ejemplo, Meylan, E., J. Tschopp, et al. (2006) . “Intracelullar pattern recognition receptors in the host response”. Nature 442 (7098) : 39-35 44) . Hasta la fecha, se han identificado al menos 10 miembros de los receptores tipo Toll (TLRs 1-10) en humanos y 13 (TLRs 1-13) en ratones. Esos receptores tipo Toll (TLRs) en humanos incluyen TLR1-TLR2 (ligando conocido: triacil lipopéptido) , TLR1-TLR6 (ligando conocido: dicail lipopéptido) , TLR2 (ligando conocido: peptidoglucano) , TLR3 (ligando conocido: ARNds) , TLR4 (ligando conocido: LPS (lipopolisacárido) de bacterias Gram-negativas) ) , TLR5 (ligando conocido: flagelinas bacterianas) ) , TLR7/8 (ligandos conocidos: imidazoquinolinas, análogos de guanosina y 40 ARNss) , TLR9 (ligandos conocidos: ADN CpG de bacterias, virus y protozoarios y hemozoína de pigmento de malaria (producto de la digestión de hemoglobina) ) y TLR10. Después del reconocimiento de patógenos microbianos, estos TLRs desencadenan típicamente vías de señalización intracelulares que dan como resultado la inducción de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, TFn-ALFA, IL-6, IL-1-beta e IL-12) , interferón tipo 1 (IFN-beta y varios IFN-alfa) y quimioquinas (Kawai, T. y S. Akira (2006) . “TLR signaling”. Cell Death Differ 13 (5) :816-25) . 45

Como parte de la respuesta inmunológica más compleja de los vertebrados, el sistema inmunológico se adapta con el tiempo para reconocer patógenos o antígenos particulares más eficientemente. Este proceso de adaptación crea memorias inmunológicas y permite una protección todavía más efectiva durante encuentros futuros con estos patógenos. Este proceso de inmunidad adaptiva o adquirida forma la base para las estrategias de vacunación. En contraste con el sistema inmunógico innato descrito arriba, el sistema inmunológico adaptivo es específico de 50 antígenos y requiere el reconocimiento de “auto” o “no auto” antígenos específicos durante un proceso llamado presentación de antígenos. Además, a diferencia de las células del sistema inmunológico innato, las cuales reconocen y responden a patógenos de forma genérica, el sistema inmunológico adaptivo confiere inmunidad de larga duración o protectora al huésped, permitiendo así una respuesta más personalizada a patógenos específicos, células infectadas por patógenos o antígenos. La capacidad para montar estas respuestas personalizadas se 55 conserva en el cuerpo gracias a las llamadas “células de memoria”. Si un antígeno o un patógeno entrase/infectase el cuerpo más de una vez, se usaqn estas células de memoria específicas para eliminarlo rápidamente. El sistema inmunológico adaptivo permite así una respuesta inmunológica más fuerte, así como una memoria inmunológica, siendo posibles diferentes respuestas inmunológicas en favor de enfermedades específicas. Por ejemplo, en el caso de infecciones, cada patógeno es “recordado” por un antígeno firma, en tanto que en el caso de enfermedades 60 cancerosas, los antígenos o autoantígenos tumorales pueden ser reconocidos y neutralizados por el sistema inmunológico adaptivo.

Los principales componentes del sistema inmunológico adaptivo en vertebrados incluyen predominantemente linfocitos a nivel celular y anticuerpos a nivel molecular. Los linfocitos como componentes celulares del sistema inmunológico adaptivo incluyen células B y células T que se derivan de células madre hematopoyéticas de la médula ósea. Las células B están implicadas en la respuesta humoral, mientras que las células T están implicadas en la respuesta inmunológica mediada por células. Tanto las células B como las células T portan moléculas receptoras 5 que reconocen dianas específicas. Las células T reconocen una diana “no auto”, tal como una estructura diana patógena, sólo después de que antígenos (por ejemplo, fragmentos pequeños de un patógeno) han sido procesados y presentados en combinación con un “auto” receptor llamado molécula de complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) . En contraste, el receptor específico de antígenos de células B es una molécula de anticuerpo de la superficie de las células B y reconoce los patógenos como tales cuando los anticuerpos sobre sus superficies se unen a un 10 antígeno extraño específico. Este complejo antígeno/anticuerpo es asimilado por la célula B y procesado mediante proteólosis en péptidos. La célula B presenta después estos péptidos antigénicos sobre sus moléculas superficiales MHC clase II. Esta combinación de MHC y antígeno atrae una célula T auxiliar coincidente, la cual libera linfocinas y activa la célula B. Al empezar a dividirse la célula B activada, su progenie secreta millones de copias del anticuerpo que reconoce este antígeno. Estos anticuerpos circulan en el plasma sanguíneo y la linfa, se unen a patógenos o 15 células tumorales que expresan el antígeno y los marcan para su destrucción por la activación de un complemento o para su absorción y destrucción por fagocitos. Como un componente celular del sistema inmunológico adaptivo, las células T citotóxicas (CD8+) también pueden formar una respuesta CTL. Las células T citotóxicas (CD8+) pueden reconocer péptidos de patógenos endógenos y autoantígenos unidos por moléculas MHC... [Seguir leyendo]

1. Composición inmunoestimuladora que comprende a) un componente adyuvante, que comprende o consiste en al menos un ARN (m) complejado con un compuesto policatiónico que es un péptido o proteína policatiónico, como un primer componente, y

b) al menos un ARNm libre que codifica para al menos un antígeno, como un segundo componente, 5

donde la composición inmunoestimuladora es capaz de provocar o incrementar una respuesta inmune innata en un mamífero y donde la relación molar entre el ARN (m) del componente adyuvante a) y el al menos un ARNm libre del segundo componente b) está en el rango de 0, 1:1 a 1:0, 01.

2. Composición inmunoestimuladora según la reivindicación 1, caracterizada porque el al menos un ARN (m) del componente adyuvante se selecciona de un oligonucleótido de ARN corto, un ARN de codificación, 10 incluyendo un ARNm, un ARN inmunoestimulador, un ARNsi, un ARN antisentido, o ribo-interruptores, ribozimas o aptámeros.

3. Composición inmunoestimuladora según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el al menos un ARN (m) del componente adyuvante es un ARNm.

4. Composición inmunoestimuladora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el al 15 menos un ARNm libre y el al menos un ARN (m) del componente adyuvante son idénticos entre sí.

5. Composición inmunoestimuladora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el al menos un ARNm libre y el al menos un ARN (m) del componente adyuvante son diferentes uno del otro.

6. Composición inmunoestimuladora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la relación N/P en el componente adyuvante está en el rango de 0, 5-2, preferentemente de 0, 7-2 y en especial 20 de 0, 7-1, 5.

7. Composición inmunoestimuladora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque la relación molar entre el ARN (m) del componente adyuvante y el al menos un ARNm libre del segundo componente b) puede seleccionarse de una relación molar de aproximadamente 1:1.

8. Composición inmunoestimuladora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el al 25 menos un ARNm libre y/o el al menos un ARN (m) del componente adyuvante están estabilizados con GC.

9. Composición inmunoestimuladora según la reivindicación 8, caracterizada porque el contenido en G/C de la región de codificación del ARN estabilizado con GC incremento en comparación con el contenido en G/C de la región de codificación del ARN nativo, no estando alterada la secuencia de aminoácidos codificada del ARN (m) modificado estabilizado con GC en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada del 30 ARN (m) modificado nativo.

10. Composición inmunoestimuladora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque el compuesto policatiónico se selecciona de protamina, nucleolina, espermina o espermidina, poli-L-lisina (PLL) , polipéptidos básicos, poli-arginina, péptidos de penetración celular (CPPs) , CPPs quiméricos, incluyendo Transportan o péptidos MPG, péptidos de unión a VIH, Tat, HIV-1 Tat (HIV) , péptidos derivados 35 de Tat, oligoargininas, miembros de la familia penetratina, incluyendo Penetratina, péptidos derivados de Antenapedia (de Drosophila antennapedia) , pAntp, plsl, CPPs derivados antimicrobianos, incluyendo buforin-2, Bac715-24, SynB, SynB (1) , pVEC, péptidos derivados de hCT, SAP, MAP, KALA, PpTG20, péptidos ricos en prolina, L-oligómeros, péptidos ricos en arginina, péptidos de calcitonina, FGF, lactoferrina, poli-L-lisina, poli-arginina, histonas, péptidos derivados o análogos de VP22, HSV, VP22 40 (herpes simple) , MAP, KALA o dominios de transducción de proteínas incluyendo PTDs, PpT620, péptidos ricos en prolina, péptidos ricos en arginina, péptidos ricos en lisina, Pep-1 y péptidos de calcitonina, o de proteínas o péptidos que tienen la siguiente fórmula total: (Arg) l; (Lys) m; (His) n; (Orn) o; (Xaa) x, donde l + m + n + o + x = 8-15, y l, m, n u o, independientemente unos de otros, pueden ser cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15, siempre que el contenido total de Arg, 45 Lys, His y Orn represente al menos 50% de todos los aminoácidos del oligopéptido; y donde Xaa puede ser cualquier aminoácido seleccionado de aminoácidos nativos (= de origen natural) o no nativos excepto de Arg, Lys, His u Orn; y x puede ser cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 siempre y cuando el contenido total de Xaa no exceda el 50% de todos los aminoácidos del oligopéptido; o de oligoargininas, incluyendo Arg7, Arg8, Arg9, Arg7, H3R9, R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, (RKH) 4, Y (RKH) 2R; o 50 de poliaminoácidos, incluyendo β-aminoácido-polímeros o poliamidas inversas 11. Composición inmunoestimuladora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque el al menos un ARN libre codifica para un antígeno se selecciona de antígenos tumorales, incluyendo 5T4.

70. AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, alfa5beta1-integrina, alfa5beta6-integrina, alfa-metilacil-coenzima A racemasa, ART-4, B7H4, BAGE-1, BCL-2, BING-4, CA 15-3/C.

2. 29, CA 19-9, C.

7. 4, CA125, 55 calreticulina, CAMEL, CASP-8, catepsina B, catepsina L, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA, CLCA2, CML28, proteína igual a Coactosina, colágeno XIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, ciclina B1, ciclina D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10/MAGE-B1, DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1,

EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, EZH2, FGF-5, FN, Fra-1, G250/CAIX, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, HAGE, HAST-2, hepsina, Her2/neu/ErbB2, HERV-K-MEL, HNE, homoebox NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, receptor de laminina inmaduro, calicreína 2, calicreína 4, Ki67, KIAA0205, KK-LC-1, KM-HN-1, LAGE-1, Livin, MAGE-A1, MAGE-A10, 5 MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B65, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, mamaglobina A, MART-1/Melan-A, MART-2, proteína de matriz 22, MC1R, M-CSF, mesotelina, MG50/PXDN, MMP 11, MN/CA IX-antígeno, MRP-3, MUC1, MUC2, NA88-A, N-acetilglucosaminiltransferasa-V, Neo-PAP, NGEP, 10 NMP22, NPM/ALK, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1, OFA-Ilrp, OGT, OS-9, osteocalcina, ostepontina, P15, P15, P190 menor BCR-ABL, P53, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PAP, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-quinasa, Pin1, POTE, PRAME, prosteína, proteinasa-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, RAGE-1, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP, survivina, survivina-2B, TA-90, TAG-72, TARP, TGFb, TGFbRII, TGM-4, TRAG-3, TRG, 15 TRP-1, TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, tirosinasa, UPA, VEGF, VEGFR-2/FLK-1, WT1; o se selecciona de antígenos mutados expresados en enfermedades cancerosas, incluyendo alfa-actinina-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, beta-catenina/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R1701, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, 20 MUM-2/m, MUM-3/m, clase miosina l/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Rsas/M, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRK/m, RBAF600/m, SIRT2/m, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII, TPI/m.

12. Composición inmunoestimuladora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque el al menos un ARNm libre codifica para: 25

a) al uno, dos, tres o cuatro antígenos (diferentes) del siguiente grupo de antígenos:

 PSA (Antígeno Específico de Próstata) = KLK3 (calicreína-3) ,

 PSMA (Antígeno de Membrana Específico de Próstata) ,

 PSCA (Antígeno de Células Madre de Próstata) ,

 STEAP (Antígeno Epitelial de Seis Transmembranas de la Próstata) , 30

o

b) al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce antígenos (diferentes) del siguiente grupo de antígenos:

 hTERT,

 WT1, 35

 MAGE-A2,

 5T4,

 MAGE-A3,

 MUC1,

 Her-2/neu, 40

 NY-ESO-1,

 CEA,

 Survivina,

 MAGE-C1, y/o  MAGE-C2, 45

donde cualquier combinación de estos antígenos es posible.

13. Composición farmacéutica que comprende un componente adyuvante, el cual comprende o consiste en al menos un ARN (m) complejado con un compuesto policatiónico, que es un péptido o proteína policatiónico, como un primer componente, y al menos un ARNm libre que codifica para al menos un antígeno, como un segundo componente, 50

donde la composición inmunoestimuladora de capaz de desarrollar o mejorar una respuesta inmune innata y adaptativa en un mamífero, y donde la la composición inmunoestimuladora se prepara por un método que comprende los siguientes pasos:

a) preparar un componente adyuvante que comprende o consiste en el al menos un ARN (m) complejado con un compuesto policatiónico que es un péptido o proteína policatiónico, mezclando el al menos un 55 ARN (m) con el compuesto catiónico o policatiónico, que es un péptido o proteína policatiónico, de forma que la relación N/P en el componente adyuvante esté en el rango de 0, 3-4; y

b) preparar la composición inmunoestimuladora añadiendo el al menos un ARNm libre en una proporción específica al componente adyuvante preparado de acuerdo con la etapa a) , de forma que la relación molar entre el ARN (m) del componente adyuvante y el al menos un ARNm libre del segundo componente esté en el rango de 0, 1:1 a 1:0, 01.

14. Composición farmacéutica que comprende una composición inmunoestimuladora según cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 a 13 y opcionalmente un portador, adyuvante y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Composición farmacéutica según la reivindicación 14, caracterizada porque la composición farmacéutica es una vacuna.

16. Método para preparar una composición inmunoestimuladora según se define de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende las siguientes etapas: 10

a) preparar un componente adyuvante que comprende o consiste en al menos un ARN (m) complejado con un compuesto policatiónico, que es un péptido o proteína policatiónico, mezclando en una relación específica el al menos un ARN (m) y un compuesto policatiónico como el definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12; y

b) preparar la composición inmunoestimuladora de la invención añadiendo en una relación específica al 15 menos un ARNm libre como el definido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 al componente adyuvante preparado de acuerdo con la etapa a) , donde el al menos un ARNm libre codifica para al menos un antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

17. Uso de una composición inmunoestimuladora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o de un componente adyuvante que comprende o consiste en al menos un ARN (m) complejado con un compuesto 20 policatiónico, que es un péptido o proteína policatiónico, y al menos un ARNm libre, donde el al menos un ARNm libre codifica para al menos un antígeno, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para la preparación de una composición farmacéutica para la profilaxis, tratamiento y/o reducción de cualquiera de las enfermedades y trastornos seleccionados de canceres o enfermedades tumorales, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas, incluyendo enfermedades infecciosas virales, 25 bacterianas o protozoológicas, o alergia o enfermedades alérgicas.

18. Kit que comprende la composición inmunoestimuladora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y/o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, y opcionalmente instrucciones técnicas con información sobre la administración y dosis de la composición inmunoestimuladora y/o de la composición farmacéutica. 30

19. Composición inmunoestimuladora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para su uso en la profilaxis, tratamiento y/o reducción de una enfermedad, que comprende a) un componente adyuvante, que comprende o consiste en al menos un ARN (m) complejado con un compuesto policatiónico que es un péptido o proteína policatiónico, como un primer componente, y

b) al menos un ARNm libre que codifica para al menos un antígeno, como un segundo componente, 35

donde la composición inmunoestimuladora es capaz de provocar o incrementar una respuesta inmune innata u opcionalmente una respuesta inmune adaptativa en un mamífero y donde el uso comprende administrar la composición a un paciente que la necesita en una cantidad segura y efectiva.