Ácido nucleico que comprende o codifica para una secuencia de tallo-lazo de histona y poli(A) o una señal de poliadenilación para incrementar la expresión de una proteína codificada.

Secuencia de ácido nucleico que comprende o codifica para

a) una región de codificación que codifica para un péptido o proteína terapéuticamente activos,

una proteína adyuvante, un antígeno, un antígeno tumoral, un antígeno patogénico, un antígeno animal, un antígeno viral, un antígeno protozoal, un antígeno bacteriano, un antígeno alergénico, un antígeno autoinmune, un alérgeno, un anticuerpo, un péptido o proteína inmunoestimulador o un antígeno específico del receptor de células T, siempre que la región de codificación no codifique para proteínas de histona, proteínas reporteras seleccionadas de EGFP y luciferasa y proteínas marcadoras o de selección seleccionadas de alfa-globina, galactoquinasa y xantina:guanina fosforribosil transferasa,

b) al menos un tallo-lazo de histona, y

c) una secuencia poli(A) o una señal de poliadenilación,

para su uso con el fin de incrementar el nivel de expresión de dicha proteína codificada tal como se define en a) en el tratamiento de enfermedades cancerosas, enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes, alergias o enfermedades alérgicas, enfermedades monogenéticas, enfermedades genéticas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neuronales, enfermedades del sistema respiratorio, del sistema digestivo, de la piel, trastornos musculo-esqueléticos, trastornos del tejido conectivo, inmunodeficiencias, enfermedades endocrinas, nutricionales y metabólicas, enfermedades oculares o del oído.

Ácido nucleico que comprende o codifica para una secuencia de tallo-lazo de histona y poli(A) o una señal de poliadenilacion para incrementar la expresión de una proteína codificada

La presente solicitud describe una secuencia de ácido nucleico codificante, en particular un ARN mensajero (ARNm), que comprende o codifica para una secuencia tallo-lazo de histona y poli(A) o una señal de poliadenilacion, asi como a su uso para incrementar la expresión de una proteína codificada. Se describe su uso para la preparación de una composición farmacéutica, en especial una vacuna, por ejemplo para su utilización en el tratamiento de enfermedades cancerosas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes o enfermedades genéticas, o en la terapia génica.

Además de las enfermedades cardiovasculares e infecciosas, la ocurrencia de tumores y enfermedades cancerosas es una de las causas de muerte más frecuentes en la sociedad moderna y, en la mayoría de los casos, está asociada a un coste considerable en términos de terapia y medidas rehabilitadorasposteriores. El tratamiento de tumores y enfermedades cancerosas depende en gran medida, por ejemplo, del tipo de tumor

que se presente, de la edad, la distribución de las células cancerosas en el paciente a tratar, etc.

Actualmente, la terapia del cáncer se lleva a cabo convencionalmente mediante el uso de terapias de radiación o quimioterapias, además de operaciones invasivas. Sin embargo, estas terapias convencionales típicamente provocanun estrés extraordinario en el sistema inmunológico y en algunos casos sólo pueden aplicarsea un nivel limitado. Además, la mayoría de estas terapias convencionales requieren largos intervalos entre los tratamientos individuales para permitir la regeneración del sistema inmunológico.

Así, en los últimos años se han investigado estrategias complementarias a estos "tratamientos

convencionales" para evitar o al menos reducir el impacto de estos tratamientos sobre el sistema

inmunológico. En particular, uno de estos tratamientos complementarios incluye enfoques de terapia génica o vacunación genética, que se ha encontrado son muy prometedores para el tratamiento o para soportar estas terapias convencionales.

La terapia génica y la vacunación genética son métodos de medicina molecular que ya han sido probados en la terapia y prevención de enfermedades y generalmente provocan un efecto considerable en la práctica médica diaria, en particular en el tratamiento de enfermedades como las anteriormente mencionadas. La terapia génica también se usa en otros campos de la medicina, por ejemplo en caso de enfermedades genéticas, es decir enfermedades (heredadas), que son causadas por un defecto génico definido y se heredan de acuerdo con las leyes de Mendel. Ejemplos bien conocidos de estas enfermedades genéticas incluyen, entre otras, mucoviscidosis (fibrosis quística) y anemia de células falciformes. Ambos métodos, terapia génica y vacunación genética, se basan en la introducción de ácidos nucleicos en las células o tejidos del paciente y procesamiento subsecuente de la información codificada por el ácido nucleico que ha sido introducido en las células o tejido, es decir la expresión (proteínica) de los polipéptidos deseados.

En los enfoques de terapia génica, típicamente se usa ADN incluso a pesar de que el ARN también se ha desarrollado recientemente. De forma importante, en todos estos enfoques de terapia génica el ARNm funciona como mensajero para la información de secuencia de la proteína codificada, independientemente de si se usa ADN, ARN viral o ARNm.

En general el ARN se considera una molécula inestable: las ARNasas son ubicuas y notoriamente difíciles de inactivar. Además, el ARN también es químicamente más lábil que el ADN. Así, tal vez sorprenda que el "estado por defecto" de un ARNm en una célula eucariótica se caracterice por una estabilidad relativa y sean necesarias señales específicas para acelerar el decaimiento de los ARNm individuales. La principal razón de este descubrimiento parece ser que el decaimiento de ARNm dentro de las células es catalizado casi exclusivamente por exonucleasas.Sin embargo, los extremos de las moléculas de ARNm eucarióticas están protegidos contra estas enzimas por estructuras terminales específicas y sus proteínas asociadas: una m7GpppN CAP en el extremo 5 y típicamente una secuencia poli(A) en el extremo 3. La eliminación de estas dos modificaciones terminales se considera así limitadora de la velocidad para el decaimiento del ARNm. Aunque se haya caracterizado un elemento estabilizador en el 3 UTR del ARNm de alfa-globina, las secuencias de ARN que afectan el cambio de las moléculas de ARNm eucarióticas actúan típicamente como un promotor de decaimiento, normalmente acelerando la desadenilación (revisado en Meyer, S., C. Temme, y col. (24), Crit Rev Biochem Mol Biol 39(4): 197-216).

Como se mencionó anteriormente, los extremos 5 de los ARNm eucarióticos son típicamente modificados post-transcripcinalmente para llevar una estructura CAP metilada, por ejemplo m7GpppN. Además de los papeles en el empalme, estabilización y transporte del ARN, la estructura CAP incrementa significativamente el reclutamiento de la subunidad ribosómica 4S al extremo 5 del ARNm durante el inicio de la traducción. Esta última función requiere el reconocimiento de la estructura CAP por el complejo de factor de inicio eucariótico elF4F. La secuencia poli(A) además estimula la traducción mediante el reclutamiento de la

subunidad 4S incrementado a moléculas de ARNm, un efecto que requiere la intervención de una proteína de unión poli(A) (PABP). PABP, a su vez, ha demostrado recientemente interactuar físicamente con elF4G, que es parte del complejo elF4F unido a CAP. Así, se postuló un modelo de lazo cerrado de inicio de traducción en moléculas de ARNm poliadeniladas de extremos bloqueados (Michel, Y. M., D. Poncet, y col. (2), J Biol Chem 275(41): 32268-76).

Prácticamente todos los ARNm eucarióticos concluyen con esta secuencia poli(A) que es añadida a su extremo 3 por la maquinaria ubicua de corte/poliadenilación. La presencia de una secuencia poli(A) en el extremo 3 es una de las características más reconocibles de los ARN eucarióticos. Después del corte, la mayoría de los pre-ARNm, excepcto los transcriptos de histona dependientes de la replicación, adquieren una cola poliadenilada. En este contexto, el procesamiento del extremo 3 es un proceso co-transcripcional nuclear que promueve el transporte del ARNm del núcleo al citoplasma y afecta a la estabilidad y la traducción de las moléculas de ARNm. La formación de este extremo 3 ocurre en una reacción de dos etapas dirigida por la maquinaria de corte/poliadenilación y depende de la presencia de dos elementos de secuencia en los precursores de ARNm (pre-ARNm); un hexanucleótido altamente conservado AAUAAA (señal de poliadenilación) y una secuencia rica en G/U aguas abajo. En una primera etapa, los pre-ARNm son cortados entre estos dos elementos. En una segunda etapa estrechamente acoplada a la primera etapa, el extremo 3 recién formado es ampliado por la adición de una secuencia poli(A) consistente en 2-25 adenilatos, que afecta posteriormente a todos los aspectos del metabolismo del ARNm, incluyendo su exportación, estabilidad y traducción (Dominski, Z. y W. F. Marzluff (27), Gene 396(2): 373-9).

Levy y col. proporciona una secuencia y una caracterización functional del exón terminal del gen receptor de la insulina humana y la identificación de cuatro dominios de poliadenilación responsablesdekl nprocesamiento del extremo 3 del ARNm del receptor de la insulina humano (Levy y col., (1995), Biochimica et Biophysica Acta 1263(3):253-257).

La WO1/12824 A1 proporciona métodos y medios para reducir la expresión de un ácido nucleico de interés, alterando con ello el fenotipo de un organismo, en particular de una planta, proporcionando un ARN diana específico no poliadenilado al núcleo de la célula huésped.

La única excepción conocida a esta regla son las moléculas de ARNm de histona dependientes de la replicación que concluyen con un tallo-lazo de histona en lugar de una secuencia poli(A). Secuencias tallo- lazo de histona ilustrativas se describen en López y col. (Dávila López, M., & Samuelsson, T. (28), RNA (Nueva York, N. Y ), 14(1), 1-1. Doi:1.1261/rna.78238).

Las estructuras tallo-lazo en pre-ARNm de histona van seguidas típicamente por una secuencia rica en purina conocida como el elemento aguas abajo de histona (HDE). Estos pre-ARNm son procesados en el núcleo por un solo corte endonucleolítico de aproximadamente 5 nucleótidos aguas abajo del tallo-lazo, catalizado por... [Seguir leyendo]

Secuencia de ácido nucleico que comprende o codifica para

a) una región de codificación que codifica para un péptido o proteína terapéuticamente activos, una proteína adyuvante, un antígeno, un antígeno tumoral, un antígeno patogénico, un antígeno animal, un antígeno viral, un antígeno protozoal, un antígeno bacteriano, un antígeno alergénico, un antígeno autoinmune, un alérgeno, un anticuerpo, un péptido o proteína inmunoestimulador o un antígeno específico del receptor de células T, siempre que la región de codificación no codifique para proteínas de histona, proteínas reporteras seleccionadas de EGFP y luciferasa y proteínas marcadoras o de selección seleccionadas de alfa-globina, galactoquinasa y xantina:guanina fosforribosil transferasa,

b) al menos un tallo-lazo de histona, y

c) una secuencia poli(A) o una señal de poliadenilación,

para su uso con el fin de incrementar el nivel de expresión de dicha proteína codificada tal como se define en a) en el tratamiento de enfermedades cancerosas, enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes, alergias o enfermedades alérgicas, enfermedades monogenéticas, enfermedades genéticas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neuronales, enfermedades del sistema respiratorio, del sistema digestivo, de la piel, trastornos musculo-esqueléticos, trastornos del tejido conectivo, inmunodeficiencias, enfermedades endocrinas, nutricionales y metabólicas, enfermedades oculares o del oído

Ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1 en el tratamiento de enfermedades infecciosas virales, bacterianas o protozoológicas.

Ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico no contiene uno o dos o al menos uno o todos pero uno o todos de los componentes del grupo consistente en: una secuencia que codifica para una ribozima o una ribozima de autoempalme, una secuencia de ácido nucleico viral, una señal de procesamiento de tallo-lazo de histona, en particular una secuencia de procesamiento de tallo-lazo de histona derivada del gen H2A614 de histona de ratón, un gen Neo, una secuencia promotora inactivada y una secuencia potenciadora inactivada.

Ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1 ó 3, caracterizado porque el ácido nucleico no contiene una ribozima, preferentemente una ribozima de autoempalme, y uno del grupo consistente en: un gen Neo, una secuencia promotora inactivada, una secuencia potenciadora inactivada, una señal de procesamiento de tallo-lazo de histona, en particular una secuencia de procesamiento de tallo-lazo de histona derivada delgen H2A14 de histona de ratón.

Ácido nucleico para su uso según las reivindicacionesl a4, caracterizado porque el ácido nucleico es un ARN, preferentemente un ARNm.

Ácido nucleico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a5, caracterizado porque el al menos un tallo-lazo de histona se selecciona de las siguientes fórmulas (I) o (II): fórmula (I) (secuencia de tallo-lazo sin elementos de borde de tallo):

[N.2GN3.5] [N.4(U/T)N.4] [N3.5CN.2J

J V._______________!

~v

~V"

~V"

steml loop stem2

fórmula (II) (secuencia de tallo-lazo con elementos de borde de tallo):

n,.6 [n.2gn3.5]

v'

[N.4(U/T)N.4J

V '

[N3.5CN.2J

'5___________)

steml steml

elemento de borde

loop stem2 stem2

elemento de borde

donde:

los elementos de borde steml o stem2 N1.6 es una secuencia consecutiva de 1 a 6, de preferencia de 2 a 6, muy preferiblemente de 2 a 5, aún más preferiblemente de 3 a 5, con total preferencia de 4 a 5 o 5 N, donde cada N se selecciona independientemente de entre un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C, o un análogo de nucleótido del mismo;

steml [N-2GN3-5] es complementario inverso o complementario inverso parcialmente del elemento stem2, y es una secuencia consecutiva de entre 5 a 7 nucleótidos; donde N-2 es una secuencia

consecutiva de a 2, de preferencia de a 1, muy preferiblemente de 1 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un nuclótido análogo de los mismos; donde N3-5 es una secuencia consecutiva de 3 a 5, de preferencia de 4 a 5, muy preferiblemente de 4 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o unanálogo de nucleótido del mismo, y donde G es guanosina o un análogo de la misma, y puede ser reemplazada opcionalmente por una citidina o un análogo de la misma siempre que su nucleótido citidina complementario en stem2 se reemplace por guanosina; la secuencia de asa [No_4(U/T)No-4] se ubica entre los elementos steml y stem2, y es una secuencia consecutiva de 3 a 5 nucleótidos, muy preferiblemente de 4 nucleótidos;donde cada N-4 es independientemente una secuencia consecutiva de a 4, de preferencia de 1 a 3, muy preferiblemente de 1 a 2 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; ydonde U/T representa uridina, u opcionalmente timidina;

stem2[N3-5CNo-2] es complementario inverso o complementario inverso parcialmente del elemento steml, y es una secuencia consecutiva de entre 5 a 7 nucleótidos;donde N3-5 es una secuencia consecutiva de 3 a 5, de preferencia de 4 a 5, muy preferiblemente de 4 N, en donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo;donde N-2 es una secuencia consecutiva de a 2, de preferencia de a 1, muy preferiblemente de 1 N, en donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; y donde C es citidina o un análogo de la misma, y puede ser reemplazada opcionalmente por una guanosina o un análogo de la misma siempre y cuando su nucleótido guanosina complementario en steml se reemplace por citidina;

donde

steml y stem2 son capaces de apareamiento de bases entre síformando una secuencia complementaria inversa, donde el apareamiento de bases puede ocurrir entre steml y stem2, o formando una secuencia complementaria parcialmente inversa, donde el apareo de bases incompleto puede ocurrir entre steml y stem2.

Ácido nucleico para su uso según la reivindicación 6, caracterizado porque el al menos un tallo-lazo de histona se selecciona de al menos una de las siguientes fórmulas (la) o (lia):

[NWCNW] [N1.3(UAT)N.2] [N3,5CN.iJ

-a________________J v----------v----------

V

~V"

loop

steml loop stem2

Fórmula (la) (secuencia de tallo-lazo sin elementos de borde de tallo)

N2.5 [N.1GN3.5l [N,.3(U/T)N.2]

W-'-------.----------------------Y-----------'

steml steml loop

elemento de borde

[Ns-sCNo.,] N

2-5

stem2 stem2

elemento de borde

Fórmula (lia) (secuencia de tallo-lazo con elementos de borde de tallo).

Ácido nucleico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a7, caracterizado porque la secuencia poli(Á) comprende una secuencia de aproximadamente 25 a alrededor de 4 nucleótidos de adenosina, preferentemente una secuencia de alrededor de 5 a aproximadamente 4 nucleótidos de adenosina, en especial una secuencia de alrededor de 5 a aproximadamente 3 nucleótidos de adenosina, en particular una secuencia de alrededor de 5 a aproximadamente 25 nucleótidos de adenosina, con especial preferencia una secuencia de alrededor de 6 a aproximadamente 25 nucleótidos de adenosina.

Ácido nucleico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a7, caracterizado porque la señal de poliadenilación comprende la secuencia de consenso NNUANA, preferentemente AAUAAA o AUUAAA.

1. Ácido nucleico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a9, caracterizado porque el ácido nucleico es un ácido nucleico monocistrónico, bicistrónico o incluso multicistrónico.

11. Composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico tal como se ha definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 para su uso parea incrementar la expresión de la protema

codificada por la región codificante de dicho ácido nucleico como se fefine en cualquiera de las

reivindicaicones 1 a 1, en el tratamiento de enfermedades cancerosas, enfermedades infecciosas,enfermedades autoinmunes, alergias o enfermedades alérgicas, enfermedades monogenéticas, enfermedades genéticas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neuronales, enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades del sistema digestivo, 1 enfermedades de la piel, trastornos musculoesqueléticos, trastornos del tejido conectivo, deficiencias

inmunológicas, enfermedades endocrinas, nutricionales y metabólicas, enfermedades oculares o enfermedades del oído.

12. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 11, que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Composición farmacéutica para su uso según las reivindicaciones 11 o 12, en el tratamiento de

enfermedades infecciosas virales, bacterianas o protozoológicas.

14. Vacuna que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que codifica para una proteñína antigénica o que comprende una antígeno de proteína para uso para aumentar la expresión de dicho antígeno de proteína en el tratamiento de enfermedades 2 cancerosas, enfermedades infecciosas, alergias o enfermedades alérgicas o enfermedades

autoinmunes.

15. Vacuna para su uso según la reivindicación 14 en el tratamiento de enfermedades infecciosas virales, bacterianas o protozoológicas.

16. Vacuna para su uso según las reivindicaciones 14 o 15, caracterizada porque el antígeno se

selecciona de entre antígenos tumorales, antígenos alergénicos, auto-antígenos autoinmunes,

antígenos patogénicos, antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos fúnglcos, antígenos protozoológicos, antígenos animales o antígenos alergénicos.