Inmunoestimulación mediante un RNA modificado químicamente.

Utilización de un RNA de cadena simple que presenta como mínimo una modificación química,

donde la modificación química es una estructura 5'-cap, para la preparación de un agente inmunoestimulador como adyuvante para mejorar la respuesta inmune.

Inmunoestimulación mediante un RNA modificado químicamente La presente invención se refiere a la utilización de un RNA de cadena simple modificado químicamente. La invención también se refiere a una vacuna que contiene como mínimo un antígeno junto con el agente inmunoestimulador. El RNA de cadena simple modificado químicamente según la invención y la vacuna 5 según la invención se utilizan principalmente contra enfermedades infecciosas o enfermedades cancerosas.

El RNA desempeña un papel central en la expresión de la información genética en la célula en forma de RNAm, RNAt y RNAr. Sin embargo, en algunas investigaciones también se ha comprobado que el RNA participa como tal en la regulación de algunos procesos, en particular en el organismo de mamíferos. El RNA puede ejercer la función de sustancia mensajera de comunicación (Benner, FEBS Lett. 1988, 232: 225-228) . 10 También se ha descubierto un RNA que presenta una gran homología con un RNAm normal, pero que no es traducido, sino que ejerce una función en la regulación intracelular (Brown et al., Cell 1992, 71: 527-542) . Este RNA con efecto regulador se caracteriza por una secuencia incompleta del sitio de unión de ribosomas (secuencia de Kozak: GCCGCCACCAUGG, en la que el AUG constituye el codón de iniciación (véase Kozak, Gene Expr. 1991, 1 (2) : 117-125) ) , por la que se diferencia del RNAm (normal) . Además se ha podido 15 demostrar que esta clase de RNA regulador también está presente en células activadas del sistema inmunológico, por ejemplo células CD4+T (Liu et al., Genomics 1997, 39: 171-184) .

Tanto la vacunación clásica como la vacunación genética tienen frecuentemente el problema de provocar sólo una respuesta inmune pequeña, y en consecuencia a menudo insuficiente, en el organismo a tratar o a vacunar. Por ello, con frecuencia a las vacunas se les añaden sustancias llamadas adyuvantes, es decir, 20 sustancias que pueden aumentar una respuesta inmune contra un antígeno y/o influir selectivamente en la misma. Algunos adyuvantes muy conocidos en el estado actual de la técnica son, por ejemplo, hidróxido de aluminio, el adyuvante de Freund y similares. Sin embargo, estos adyuvantes provocan efectos secundarios no deseados, por ejemplo irritaciones e inflamaciones muy dolorosas en el lugar de administración. También se observan efectos secundarios tóxicos, en particular necrosis tisulares. Por último, estos adyuvantes 25 conocidos sólo provocan una estimulación insuficiente de la respuesta inmune celular, ya que únicamente activan células B.

También se sabe que el DNA bacteriano tiene un efecto inmunoestimulador debido a la presencia de motivos CG no metilados, por lo que este DNA-CpG ha sido propuesto como medio inmunoestimulador por sí mismo y como adyuvante para vacunas; véase la patente US 5.663.153. Esta propiedad inmunoestimuladora del 30 DNA también se puede lograr a través de oligonucleótidos de DNA estabilizados mediante modificación con fosforotioato (patente US 6.239.116) . Finalmente, la patente US 6.406.705 da a conocer composiciones de adyuvante que contienen una combinación sinérgica de un oligodesoxirribonucleótido-CpG y un adyuvante que no es ácido nucleico.

Sin embargo, la utilización de DNA como agente inmunoestimulador o como adyuvante en vacunas es 35 desventajosa desde varios puntos de vista. El DNA se descompone en la corriente sanguínea a una velocidad relativamente lenta, por lo que al utilizar DNA inmunoestimulador se puede producir una formación de anticuerpos anti-DNA, como ha sido confirmado en el modelo animal con ratones (Gilkeson et al., J. Clin. Invest. 1995, 95: 1398-1402) . La posible persistencia del DNA en el organismo puede conducir a una sobreactivación del sistema inmunológico, que, como es sabido, en los ratones resulta en una 40 esplenomegalia (Montheith et al., Anticancer Drug Res. 1997, 12 (5) : 421-432) . Además, el DNA puede interaccionar con el genoma huésped, en particular puede provocar mutaciones por integración en el genoma huésped. Por ejemplo, se puede producir una inserción del DNA introducido en un genoma intacto, lo que constituye una mutación que obstaculiza o elimina por completo la función del gen endógeno. Estos sucesos de integración pueden eliminar sistemas enzimáticos de vital importancia para la célula, y además existe el 45 peligro de que la célula así modificada se transforme quedando en un estado degenerado si mediante la integración del DNA extraño se modifica un gen decisivo para la regulación del crecimiento celular. Por ello, si se utiliza DNA como agente inmunoestimulador no se puede excluir el riesgo de cancerización.

Riedl y col. (J. Immunol 2002, 168 (10) : 4951-4959) manifiestan que un RNA unido a un dominio rico en Arg de la nucleocápsida HBcAg provoca una respuesta inmune mediada por Th1 contra HbcAg. El dominio rico 50 en Arg de la nucleocápsida presenta similitud con protaminas y se une a ácidos nucleicos de forma no específica.

Gr y aznov S. M. (Biochimica et Biophysica Acta, 1999, 1489, S. 131-140) describen un análogo modificado de un ácido nucleico, en particular un N3->P5 fosforamidato-oligonucleótido, el contiene 3-amino- en vez de 3-hidroxil-nucleósido. Los enlaces proporcionan un dúplex muy estable con un fosfodiéster-DNA 55 complementario nativo y un dúplex muy estable con las cadenas de ARN.

Agrawal, S. (Trends in Biotechnology, Elsevier Publications, 1996, Cambridge, GB, Bd. 14, Nº 10, P. 376-387) se refiere a un oligonucleótido anti-sentido que tiene la capacidad de bloquear selectivamente genes que provocan enfermedades, impidiendo la producción de proteínas asociadas a la enfermedad. La especificidad y la aplicación de los oligonucleótidos anti-sentido para diferentes enfermedades fueron validadas en un modelo animal. 5

La EP 0 839 912 A1 se refiere a un método para la preparación de un clon infeccioso basado en el genoma de una RNA-virus, donde se utiliza un genoma de al menos 15 kb. Además, de describe aquí RNA-virus modificados y una vacuna, así como análisis diagnósticos de estos derivados.

La WO 01/93902 A2 proporciona composiciones inmunológicas y métodos para preparar oligonucleótidos híbridos de DNA/RNA inmunoestimuladores donde se codifica para una o más motivos CpG. La 10 administración de estos compuestos, solos o en combinación con uno o más antígenos diana, favorece la inmunidad innata y específica de antígeno.

Ara Y. y col. (Immunology 2001, 103, P. 98-105) describen el efecto adyuvante del zimosan en relación con una vacuna de DNA específica del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) y el mecanismo de este refuerzo. El mecanismo fue valorado en un modelo de ratón. Los resultados obtenidos demuestran que 15 el zimosan es un adyuvante inmunológico eficaz en relación a una vacuna de DNA contra elVIH-1.

Heyman, B. (Immunology Today, 1990, 11, P. 310-313) se refieren a la regulación mediada por anticuerpos de la respuesta inmune humoral bajo el énfasis de sistemas in vivo, inyectándose los antígenos junto anticuerpos de IgM o IgG altamente purificados en ausencia de adyuvantes.

Galbraith, W.M. (Antisense Res. Dev., 1994, 4, P. 201-206) informan sobre la activación complementaria y la 20 alteración hemodinámica después de la administración intravenosa de fosfotioato-oligonucleótidos en el mono.

La presente invención tiene por objetivo proporcionar un nuevo sistema para mejorar la inmunoestimulación en general y la vacunación en particular, que provoque una respuesta inmune especialmente eficaz en el paciente a tratar o a vacunar y que no obstante evite las desventajas de los inmunoestimuladores conocidos. 25

Este objetivo se resuelve mediante las formas de realización de la presente invención caracterizadas en las reivindicaciones.

Por consiguiente, según la presente invención se reivindica la utilización de un RNA monohebra modificado químicamente para la producción de un agente inmunoestimulador.

La presente invención se basa en la sorprendente constatación de que el RNA modificado químicamente 30 activa con especial intensidad células del sistema inmunológico (sobre todo células presentadoras de antígenos, en particular células dendríticas (DC) , y también las células defensoras, por ejemplo en forma de células T) , y de este modo estimula el sistema inmunológico de un organismo. En particular, la preparación según la invención del agente inmunoestimulador que contiene el RNA modificado químicamente conduce a un aumento de la liberación de 35

También se reivindica el RNA monohebra modificado químicamente tal como se ha definido anteriormente como adyuvante para su utilización en un procedimiento para la mejora de la respuesta... [Seguir leyendo]

1. Utilización de un RNA de cadena simple que presenta como mínimo una modificación química, donde la modificación química es una estructur.

5. cap, para la preparación de un agente inmunoestimulador como adyuvante para mejorar la respuesta inmune.

2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque la estructur.

5. cap se selecciona de entre 5 m7G (5) ppp, (5 (A, G (5) ppp (5) A y G (5) ppp (5) G.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el al menos un nucleótido del RNA es un análogo de nucleótidos de origen natural.

4. Utilización según la reivindicación 3, caracterizada porque el RNA consiste en análogos de nucleótidos. 10

5. Utilización según la reivindicación 3 ó 4, caracterizada porque el análogo se selecciona de entre el grupo consistente en fosforotioatos, fosforamidatos, peptidonucleótidos, metilfosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina.

6. Utilización según la reivindicación 4, caracterizada porque el análogo es un fosforotioato.

7. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el RNA consiste en 2 a 15 aproximadamente 1.000 nucleótidos.

8. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el RNA está asociado o complejado con un compuesto policatiónico.

9. Utilización según la reivindicación 8, caracterizada porque el compuesto policatiónico es protamina.

10. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque comprende como mínimo 20 otro adyuvante.

11. Utilización según la reivindicación 10, caracterizada porque el adyuvante se selecciona de entre el grupo consistente en citoquinas, lipopéptidos y oligonucleótidos-CpG.

12. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 11, que además comprende un soporte farmacéuticamente compatible y/o un vehículo farmacéuticamente compatible. 25

13. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 12 para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades infecciosas o enfermedades cancerosas.

14. Vacuna que contiene un RNA de cadena simple que presenta como mínimo una modificación química, siendo la modificación química una estructur.

5. cap, y como mínimo un antígeno.

15. Vacuna según la reivindicación 14, caracterizada porque el antígeno se selecciona de entre el grupo 30 consistente en péptidos, polipéptidos, células, extractos celulares, polisacáridos, conjugados de polisacáridos, lípidos, glicolípidos e hidratos de carbono.

16. Vacuna según la reivindicación 15, caracterizada porque el antígeno de péptido o de polipéptido está presente en forma de un ácido nucleico codificador del mismo.

17. Vacuna según la reivindicación 16, caracterizada porque el ácido nucleico es un RNAm. 35

18. Vacuna según la reivindicación 17, caracterizada porque el RNAm está estabilizado y/u optimizado en traducción.

19. Vacuna según una de las reivindicaciones 14 a 18, caracterizada porque el antígeno se selecciona de entre antígenos tumorales y antígenos de virus, bacterias, hongos y protozoos.

20. Vacuna según la reivindicación 19, caracterizada porque el antígeno viral, bacteriano, fúngico o 40 protozoológico procede de una proteína secretada.

21. Vacuna según la reivindicación 19 ó 20, caracterizada porque el antígeno es un poliepitopo de antígenos tumorales y antígenos de virus, bacterias, hongos o protozoos.

22. Utilización de una vacuna según una de las reivindicaciones 14 a 21 para la vacunación contra enfermedades infecciosas o enfermedades cancerosas.

23. RNA de cadena simple que tiene al menos una modificación química, siendo la modificación química 5 una estructur.

5. cap, para su utilización como adyuvante o para un agente inmunoestimulador para mejorar la respuesta inmune.

24. RNA de cadena simple según la reivindicación 23 para su uso como adyuvante o para un agente inmunoestimulador para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades infecciosas o cancerosas.