Complejos de ARN y péptidos catiónicos para transfección e inmunoestimulación.

ARN monohebra inmunoestimulador complejado que comprende al menos un ARN (molécula) complejado con uno o más oligopéptidosno unidos al ARN de forma covalente,

caracterizado porque la proporción nitrógeno/fosfato (ratio N/P) del al menos un ARN del ARN complejado con uno o más oligopéptidos está en el intervalo de 0,5-50 y porque el oligopéptido tiene una longitud de 8 a 15 aminoácidos y tiene la siguiente fórmula empírica:

(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x (fórmula I)

donde:

• l + m + n + o + x ≥ 8-15, yl, m, n u o, independientemente uno del otro, pueden ser cualquier número seleccionado entre 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7,8,9,10, 11, 12, 13, 14 ó 15, siempre que el contenido total de Arg, Lys, His y Orn represente al menos un 50% de todos los aminoácidos del oligopéptido; y

• Xaa puede ser cualquier aminoácido seleccionado entre aminoácidos nativos o no nativos excepto de Arg, Lys, His u Orn; y

• x puede ser cualquier número seleccionado entre 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, siempre que el contenido total de Xaa no exceda el 50% de todos los aminoácidos del oligipéptido.

Complejos de ARN y péptidos catiónicos para transfección e inmunoestimulación La presente invención se refiere a un ARN de una sola hebra complejado inmunoestimulalorio que comprende al menos un ARN (molécula) complejado con uno o más oligopéptidos, donde el oligopéptido tiene una longitud de 8 a 15 aminoácidos y la fórmula (Arg) I (Lys) rn (His) ., (Om) o (Xaa) •. Además, en la presenle invención se describen composiciones farmacéuticas y kits que comprenden el ARN complejado de la invención, así como el uso del ARN de una sola hebra complejado inmunoestimulatorio de la invenciónpara modular, preferentemente para inducir o incrementar, una respuesta inmune La transfección de ácidos nucleicos en las células o lejidos de los pacientes medianle métodos de transferencia génica es un procedimienlo principalenlamedicina molecular y juega un papel crítico en la terapia y prevención de numerosas enfermedades. Los métodos de transfección de ácidos nucleicos pueden conducir a una estimulaciÓfl inmune del tejido u organismo. Alternativa o adicionalmente, la transfección de ácidos nucleicos puede ser seguida por el procesamiento de la información codificada por los ácidos nucleicos introducidos, es decir, por la traducción de los polipéptidos o las proteinas deseados. El ADN o el ARN como ácidos nucleicos constituyen enfoques altemativos a la terapia génica. La Iransfección de ácidos nucleicos también puede conducir a una modulación, por ejemplo a la supresión o el incremento de la expresión génica, dependiendo del tipo de ácido nucleico transfectado. La transfección de estos ácidos nucleicos se lleva a cabo típicamenle mediante métodos de transferencia génica.

Los mélodos de transferencia génica en células o tejidos han sido intensamente estudiados en las últimas décadas, sin embargo con éxito limitado. Los métodos bien conocidos incluyen métodos físicos o fisicoquímicos, tales como inyección (directa) de ácidos nuceicos (desnudos) o transferencia génica biolística La transferencia génica biolística (también conocida como bombardeo de partículas biolístico) es un método desarrollado por la Universidad de Comell que permite introducir material génico en tejidos o cultivos celulares. La transferencia génica biolística se lleva a cabo típicamente mediante el recubrimiento superficial con partículas metálicas, por ejemplo de oro o plata, disparando estas partículas metálicas, que comprenden ADN adsorbido, en las células empleando una pistola génica. Sin embargo, los métodos de transferencia génica biolística aún no han demostrado funcionar con el ARN, probablemente debido a su rápida degradación. Además, estos métodos no son adecuados para aplicaciones in vivo, lo que representa una gran limitación práctica Los métodos físicos o fisicoquímicos altemativos incluyenla electropOfación in vitro La electroporación in vitro se basa en el uso de cOfriente de alto voltaje para hacer que las membranas celulares sean permeables y permitan la introducción de nuevo ADN o ARN en la célula. Por tanto, normalmente las paredes celulares se debilitan antes de la transfección bien con compuestos químicos o bien con un proceso cuidadoso de congelación para hacerlos ~electrocompetentes· Si las bacterias o células electrocompetentes (por ejemplo células eucarióticas) y el ADN (o el ARN) se mezclas conjuntamente, el plásmido puede transferirse a la célula empleando una descarga eléctrica para llevar el ADN (o el ARN) al interior de las células en la trayectoria de la descarga que cruza la cámara de reacción.

Otro método físico o fisicoquímico alternativo incluye el uso de nanoplejos (sistemas de nanopartículas) , lipoplejos (sistemas liposomiales) o el uso de poliplejos o polímeros catiónicos. Tales nanoplejos (sistemas de nanopartículas) implican el uso de poliacrilatos, poliamidas, poliestireno, cianoacrilatos, polilactato (PLA) , ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA) , polietilo, etc. como sistemas vehiculo para el transporte de los ácidos nucleicos al interior de células o tejidos. Los lipoplejos o los sistemas liposomialesimplican típicamente el uso de lípidos catiónicos, los cuales son capaces de emularla membrana celular. Así, la parte cargada positivamente de los lípidos interactúa con la parte cargada negativamente de los ácidos nucleicos haciendo posible la fusión con la membrana celular. Los lipoplejos o sistemas liposomiales incluyen, por ejemplo, DOTMA, DOPE, DOSPA, DOTAP, DC-Chol, EDMPC, etc. Los poliplejos (polímeros catiónicos) típicamente forman un complejo con ácidos nucleicos cargados negativamente que lleva a una condensación de los ácidos nucleicos y los protege de la degradación. El transporte a las células usando poliplejos (polímeros catiónicos) se lleva a cabo típicamente víauna endocitosis mediada por receptor. De esta manera, el ADN está acoplado a una molécula distinta, tal como una trasferrina, por ejemplo con el poliplejo poli-L-lisina (PLL) , el cual se une a un receptor superficial y desencadena la endocitosis. Los poliplejos (polímeros catiónicos) incluyen, por ejemplo, poli-L-lisina (PLL) , quitosano, polietilenimina (PEI) , metacrilalo depoli (dimetilaminoetilo) (PD-MAEMA) , poliamidoamina (PAMAM) .

Otros métodos fisicos o fisicoquimicos bien conocidos de transferencia génica en células u organismos incluyen aquellos tales como de transfección mediante virus. Como ejemplo particular, un virus ADN puede usarse como vehículopara el ADN Debido a sus propiedades infecciosas, estos virus tienen una velocidad de transfección muy alta. Los virus típicamente empleados se modifican genéticamente de manera que no se forme partícula infecciosa funcional algune en la célula transfectada. A pesar de esta precauciÓfl de seguridad, sin embargo, no puede descartarse cierto riesgo de propagación incontrolada de los genes terapéutica mente activos introducidos y de los genes virales, por ejemplo, debido a posibles eventos de recombinación Más ventajoso en este contexto es el uso de las llamadas proteínas translocadoras o de dominios de transducción (PTOs) para el transporte de macromoléculas al interior de células o tejidos. Las proteínas translocadoras se consideran como un grupo de péptidos capaces de llevar a cabo el transporte de macromoléculas entre células (proteínas translocadoras) , tales como VIH -tat (VIH) , antennapedia (Drosophila antennapedia) , HSV VP22 (Herpes simplex) , FGF o lactoferrina, etc. Por el contrario, los dominios de transducción de proteínas (PTOs) se consideran como un grupo de péptidos capaces de dirigir las proteínas y péptidos unidos covalentemente a estas secuencias dentro de una célula a través de la membrana celular (Leifert y Whitton: Translocator y proteins and protein transduction domains: a critical analysis of their biological effects and the under1ying mecchanisms. Molecular Therapy vol. 8 No. 2003) . Común a las proteínas translocadoras y a los PTOs es una región básica, la cual se considera como principalmente responsable del transporte de los péptidos de fusión, ya que es capaz de unir polianiones tales como ácidos nucleicos. Sin limitarse a éstos, los PTOs pueden actuar de forma similar a reactivos de transfección catiónica usando endocitosis adsorbente no saturable dependiente del receptor. Los PTOs se acoplan tipicamente a proteínas o péptidos con el fin de llevar a cabo o incrementar una respuesta CTL cuando se administra una vacuna basada en péptidos (véase Melikov y Chemomordik, Arginine-rich cell penetrating peptides: from endosomal uptake to nuclear deliver y , Cell. Mol. Life Sci. 2005) .

A veces, los dominios de transducción de proteína (PTOs) sedenominan también "péptidos penetrantes celulares" (CPPs) por su capacidad de penetrar la membrana celular y así llevar a cabo el transporte de macromoléculas al interior de las células. Los CPPs son péptidos pequeños, comprenden tipicamente un alto contenido en aminoácidos básicos y tienen una longitud de 7 a 30 aminoácidos Macromoléculas que han mostrado ser transportadas al interior de las células por medio de CPPs incluyen péptidos, asi como AON, ARNsi o PNAs (ácidos nucleicos péptidos) , uniéndose los CPPs típicamente a estas macromoléculas mediante un enlace covalente, y siendo transfectados en las células. Aunque los péptidos penetrantes de células (CPPs) se han empleado con éxito para mediar el suministro intracelular en una amplia variedad de moléculas de interés farmacológico tanto in vitro como in vivo, los mecanismos por los cuales ocurre la absorción celular aún siguen sin esclarecerse. El grupo de los CPPs es altamente diverso y está formado por péptidos anfifáticos y helicoidales tales como transportano, penetratina, péptidos hidrófobos como MTS, VP22, MAP, KALA, PpTG20,... [Seguir leyendo]

, . ARN monohebra inmunoestimulador complejado que comprende al menos un ARN (molécula) complejado con uno o más oligopéptidosno unidos al ARN de forma covalente, caracterizado porque la proporción nitrógeno/fosfato (ratio N/P) del al menos un ARN del ARN complejado con uno o más oligopéptidos está en el intervalo de 0, 5-50 y porque el oligopéptido tiene una longitud de 8 a 15 aminoácidos y tiene la siguiente fórmula empírica "

(Arg) ¡; (LYS) rn; (HiS) n; (Om) ., ; (xaah (fórmula 1)

donde"

• I + m + n + o + x = 8-15, yl, m, n u o, independientemente uno del otro, pueden ser cualquier número seleccionado entre O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14615, siempre que el contenido total de Arg, Lys, His y Om represente al menos un 50% de todos los aminoácidos del oligopéptido; y

• Xaa puede ser cualquier aminoácido seleccionado entre aminoácidos nativos o no nativos 15 excepto de Arg, Lys, His u Om; y

• x puede ser cualquier número seleccionado entre O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, siempre que el contenido total de Xaa no exceda el 50% de todos los aminoácidos del oligipéptido

2. ARN complejado según la reivindicación 1, caracterizado porque el al menos un ARN (molécula) es un ARNm.

3. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el oligopéptido tiene una longitud de 8 a 14, 8 a 13, 8 a 12, 69 a 12 ó 9 a 11 aminoácidos.

4. ARN complejado segúncualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el contenido total de Arg, Lys, His y Orn representa al menos el 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de todos los aminoácidos del oIigopéptido del ARN complejado

5. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque Xaa en la fórmu la empirica (Arg~; (Lys) rn; (His) rn; (Om) Q; (xaa) . se selecciona de entre aminoácidos que tienen una cadena lateral neutra, incluyendo aminoácidos que tienen una cadena lateral hidrófoba neutra y aminoácidos que tienen una cadena lateral polar neutra

6. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el oligopéptido de fórmula empírica (Arg) I; (LYS) rn; (His) n; (Om) o; (Xaa) . no comprende aminoácidos en uno o en ambos extremos terminales, que comprenden una cadena lateral ácida

7. ARN complejado segúncualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el oligopéptido de fórmu la empírica (Arg~; (LYS) m; (His) n; (Om) .:, ; (Xaa) . comprende aminoácidos neutros o básicos en uno o en ambos extremos terminales, o aminoácidos básicos en uno o en ambos extremos

terminales y al menos uno, preferentemente al menos dos, en especial al menos tres aminoácidos básicos en ambos extremos terminales

8. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el oligopéptido de fórmula empírica (Arg) I; (Lys) rn; (His) n; (Orn) o; (Xaa) x comprende un tramo de al menos 3 aminoácidos básicos contiguos dentro de su secuencia.

9. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el oligopéptido de fórmula empírica (Arg) I; (LYS) m; (His) n; (Om) .:, ; (Xaa) . comprende al menos 1, 2 ó 3 aminoácidos no catiórJicos en uno o ambos extremos terminales, seleccionándose preferentemente el aminoácido no catiónico de histidina.

10. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el almenos un

ARN (molécula) del ARN complejado es un ARNm, codificando el ARNm para una proteína o un péptido terapéuticamente activos, una proteina o péptido inmunoestimulador, un antígeno tumoral o un anticuerpo

11. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el ARN es un ARN modificado, en particular un ARN estabilizado, en comparación con el ARN tipo salvaje.

12. ARN complejado segúncualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porquela relación en masa entre el al menos un ARN (molécula) del ARN complejado y el uno o más oligopéptidos está

en un intervalo de 1 :100 a 1 :0, 5, o tiene un va lor de 1 :50 a 1:1 , 1 :100, 1 :90, 1 :80, 1 :70, 1 :60, 1 :50 ,

1:45, 1:40, 1:35, 1:30, 1:25, 1:20, 1:15, 1:10, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1 o 1:0, 5

13. ARN complejado según cua lquiera de las reivindicaciooes 1 a 11 , caracterizado porque la relaciórJ

molar entre el al menos un ARN (molécu la) del ARN complejado y el uno o más oligopéptidos está

5 en un intervalo de 1 :20.000 a 1 :500 o 1 :250, o en uninlervalo de 1 :10.000 a 1 :1.000, o tiene un va lor

de 1 :9.500 a 1 :9.000, 1 :8.500, 1 :8.000, 1 :7.500, 1 :7.000, 1 :6.500, 1 :6.000, 1 :5.500, 1:5.000, 1 :4.S00 ,

1 :4 .000, 1 :3.500, 1 :3.000, 1 :2.500, 1 :2.000 , 1 :1.500, 1 :1.000, 1 :500, 1 :450 , 1 :400, 1 :350, 1 :300 o

1:250

14. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , caracterizado porque la proporción

10 nitrógenolfosfato (ratio N/P) está en un intervalo de 0, 75-25.

15. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el

ol igopéptido se selecciona de entre el grupo consistente en:ArggHis3, HisJArggHis3,

TyrSerSerArggSerSerTyr, HisJArggSerSerTyr, (ArgLysHis) 4 , Tyr (ArgLysHis) zArg ;o deArgs, Argg,

ArglO, Arg ll, Arg l2, Argl 3, Argl4, Arg1 5 (SEO ID NOs: 1-B) ; LYS8, LyS9, LYS10, LYS 11, LYS I2, LYS I3, LYSI4,

15 LyS15 (SEO ID NOs: 9-1 6) ;Hisa, HiSg, His lO, His11, His12, Hisl3, His14, His15 (SEO ID NOs' 17-24) y

Oma, Omg, OrnlO, Om", Om'2, Omll, Om, 4, Orn '5 (SEO ID NOs.

2. 32)

16. ARN complejado según cua lquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el ARN

complejado se formu la como una composición farmacéutica.