Complejos de ARN y péptidos catiónicos para transfección e inmunoestimulación.

ARN monohebra inmunoestimulador complejado que comprende al menos un ARN (molécula) complejado con uno o más oligopéptidosno unidos al ARN de forma covalente,

caracterizado porque la proporción nitrógeno/fosfato (ratio N/P) del al menos un ARN del ARN complejado con uno o más oligopéptidos está en el intervalo de 0,5-50 y porque el oligopéptido tiene una longitud de 8 a 15 aminoácidos y tiene la siguiente fórmula empírica:

(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x (fórmula I)

donde:

• l + m + n + o + x ≥ 8-15, yl, m, n u o, independientemente uno del otro, pueden ser cualquier número seleccionado entre 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7,8,9,10, 11, 12, 13, 14 ó 15, siempre que el contenido total de Arg, Lys, His y Orn represente al menos un 50% de todos los aminoácidos del oligopéptido; y

• Xaa puede ser cualquier aminoácido seleccionado entre aminoácidos nativos o no nativos excepto de Arg, Lys, His u Orn; y

• x puede ser cualquier número seleccionado entre 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, siempre que el contenido total de Xaa no exceda el 50% de todos los aminoácidos del oligipéptido.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E12002779.

Solicitante: CUREVAC GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: PAUL-EHRLICH-STRASSE 15 72076 TUBINGEN ALEMANIA.

Inventor/es: FOTIN-MLECZEK Mariola, BAUMHOF,PATRICK.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K47/48 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 47/00 Preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos utilizados, p. ej. portadores, aditivos inertes. › estando el ingrediente no activo químicamente unido al ingrediente activo, p. ej. conjugados polímero-medicamento.
  • A61K48/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
  • C07K19/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Péptidos híbridos (Inmoglobulinas híbridas compuestas   solamente de inmoglobulinas C07K 16/46).
  • C12N15/87 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Introducción de material genético extraño utilizando procedimientos no previstos en otro lugar, p. ej. cotransformación.

PDF original: ES-2539188_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Complejos de ARN y péptidos catiónicos para transfección e inmunoestimulación La presente invención se refiere a un ARN de una sola hebra complejado inmunoestimulalorio que comprende al menos un ARN (molécula) complejado con uno o más oligopéptidos, donde el oligopéptido tiene una longitud de 8 a 15 aminoácidos y la fórmula (Arg) I (Lys) rn (His) ., (Om) o (Xaa) •. Además, en la presenle invención se describen composiciones farmacéuticas y kits que comprenden el ARN complejado de la invención, así como el uso del ARN de una sola hebra complejado inmunoestimulatorio de la invenciónpara modular, preferentemente para inducir o incrementar, una respuesta inmune La transfección de ácidos nucleicos en las células o lejidos de los pacientes medianle métodos de transferencia génica es un procedimienlo principalenlamedicina molecular y juega un papel crítico en la terapia y prevención de numerosas enfermedades. Los métodos de transfección de ácidos nucleicos pueden conducir a una estimulaciÓfl inmune del tejido u organismo. Alternativa o adicionalmente, la transfección de ácidos nucleicos puede ser seguida por el procesamiento de la información codificada por los ácidos nucleicos introducidos, es decir, por la traducción de los polipéptidos o las proteinas deseados. El ADN o el ARN como ácidos nucleicos constituyen enfoques altemativos a la terapia génica. La Iransfección de ácidos nucleicos también puede conducir a una modulación, por ejemplo a la supresión o el incremento de la expresión génica, dependiendo del tipo de ácido nucleico transfectado. La transfección de estos ácidos nucleicos se lleva a cabo típicamenle mediante métodos de transferencia génica.

Los mélodos de transferencia génica en células o tejidos han sido intensamente estudiados en las últimas décadas, sin embargo con éxito limitado. Los métodos bien conocidos incluyen métodos físicos o fisicoquímicos, tales como inyección (directa) de ácidos nuceicos (desnudos) o transferencia génica biolística La transferencia génica biolística (también conocida como bombardeo de partículas biolístico) es un método desarrollado por la Universidad de Comell que permite introducir material génico en tejidos o cultivos celulares. La transferencia génica biolística se lleva a cabo típicamente mediante el recubrimiento superficial con partículas metálicas, por ejemplo de oro o plata, disparando estas partículas metálicas, que comprenden ADN adsorbido, en las células empleando una pistola génica. Sin embargo, los métodos de transferencia génica biolística aún no han demostrado funcionar con el ARN, probablemente debido a su rápida degradación. Además, estos métodos no son adecuados para aplicaciones in vivo, lo que representa una gran limitación práctica Los métodos físicos o fisicoquímicos altemativos incluyenla electropOfación in vitro La electroporación in vitro se basa en el uso de cOfriente de alto voltaje para hacer que las membranas celulares sean permeables y permitan la introducción de nuevo ADN o ARN en la célula. Por tanto, normalmente las paredes celulares se debilitan antes de la transfección bien con compuestos químicos o bien con un proceso cuidadoso de congelación para hacerlos ~electrocompetentes· Si las bacterias o células electrocompetentes (por ejemplo células eucarióticas) y el ADN (o el ARN) se mezclas conjuntamente, el plásmido puede transferirse a la célula empleando una descarga eléctrica para llevar el ADN (o el ARN) al interior de las células en la trayectoria de la descarga que cruza la cámara de reacción.

Otro método físico o fisicoquímico alternativo incluye el uso de nanoplejos (sistemas de nanopartículas) , lipoplejos (sistemas liposomiales) o el uso de poliplejos o polímeros catiónicos. Tales nanoplejos (sistemas de nanopartículas) implican el uso de poliacrilatos, poliamidas, poliestireno, cianoacrilatos, polilactato (PLA) , ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA) , polietilo, etc. como sistemas vehiculo para el transporte de los ácidos nucleicos al interior de células o tejidos. Los lipoplejos o los sistemas liposomialesimplican típicamente el uso de lípidos catiónicos, los cuales son capaces de emularla membrana celular. Así, la parte cargada positivamente de los lípidos interactúa con la parte cargada negativamente de los ácidos nucleicos haciendo posible la fusión con la membrana celular. Los lipoplejos o sistemas liposomiales incluyen, por ejemplo, DOTMA, DOPE, DOSPA, DOTAP, DC-Chol, EDMPC, etc. Los poliplejos (polímeros catiónicos) típicamente forman un complejo con ácidos nucleicos cargados negativamente que lleva a una condensación de los ácidos nucleicos y los protege de la degradación. El transporte a las células usando poliplejos (polímeros catiónicos) se lleva a cabo típicamente víauna endocitosis mediada por receptor. De esta manera, el ADN está acoplado a una molécula distinta, tal como una trasferrina, por ejemplo con el poliplejo poli-L-lisina (PLL) , el cual se une a un receptor superficial y desencadena la endocitosis. Los poliplejos (polímeros catiónicos) incluyen, por ejemplo, poli-L-lisina (PLL) , quitosano, polietilenimina (PEI) , metacrilalo depoli (dimetilaminoetilo) (PD-MAEMA) , poliamidoamina (PAMAM) .

Otros métodos fisicos o fisicoquimicos bien conocidos de transferencia génica en células u organismos incluyen aquellos tales como de transfección mediante virus. Como ejemplo particular, un virus ADN puede usarse como vehículopara el ADN Debido a sus propiedades infecciosas, estos virus tienen una velocidad de transfección muy alta. Los virus típicamente empleados se modifican genéticamente de manera que no se forme partícula infecciosa funcional algune en la célula transfectada. A pesar de esta precauciÓfl de seguridad, sin embargo, no puede descartarse cierto riesgo de propagación incontrolada de los genes terapéutica mente activos introducidos y de los genes virales, por ejemplo, debido a posibles eventos de recombinación Más ventajoso en este contexto es el uso de las llamadas proteínas translocadoras o de dominios de transducción (PTOs) para el transporte de macromoléculas al interior de células o tejidos. Las proteínas translocadoras se consideran como un grupo de péptidos capaces de llevar a cabo el transporte de macromoléculas entre células (proteínas translocadoras) , tales como VIH -tat (VIH) , antennapedia (Drosophila antennapedia) , HSV VP22 (Herpes simplex) , FGF o lactoferrina, etc. Por el contrario, los dominios de transducción de proteínas (PTOs) se consideran como un grupo de péptidos capaces de dirigir las proteínas y péptidos unidos covalentemente a estas secuencias dentro de una célula a través de la membrana celular (Leifert y Whitton: Translocator y proteins and protein transduction domains: a critical analysis of their biological effects and the under1ying mecchanisms. Molecular Therapy vol. 8 No. 2003) . Común a las proteínas translocadoras y a los PTOs es una región básica, la cual se considera como principalmente responsable del transporte de los péptidos de fusión, ya que es capaz de unir polianiones tales como ácidos nucleicos. Sin limitarse a éstos, los PTOs pueden actuar de forma similar a reactivos de transfección catiónica usando endocitosis adsorbente no saturable dependiente del receptor. Los PTOs se acoplan tipicamente a proteínas o péptidos con el fin de llevar a cabo o incrementar una respuesta CTL cuando se administra una vacuna basada en péptidos (véase Melikov y Chemomordik, Arginine-rich cell penetrating peptides: from endosomal uptake to nuclear deliver y , Cell. Mol. Life Sci. 2005) .

A veces, los dominios de transducción de proteína (PTOs) sedenominan también "péptidos penetrantes celulares" (CPPs) por su capacidad de penetrar la membrana celular y así llevar a cabo el transporte de macromoléculas al interior de las células. Los CPPs son péptidos pequeños, comprenden tipicamente un alto contenido en aminoácidos básicos y tienen una longitud de 7 a 30 aminoácidos Macromoléculas que han mostrado ser transportadas al interior de las células por medio de CPPs incluyen péptidos, asi como AON, ARNsi o PNAs (ácidos nucleicos péptidos) , uniéndose los CPPs típicamente a estas macromoléculas mediante un enlace covalente, y siendo transfectados en las células. Aunque los péptidos penetrantes de células (CPPs) se han empleado con éxito para mediar el suministro intracelular en una amplia variedad de moléculas de interés farmacológico tanto in vitro como in vivo, los mecanismos por los cuales ocurre la absorción celular aún siguen sin esclarecerse. El grupo de los CPPs es altamente diverso y está formado por péptidos anfifáticos y helicoidales tales como transportano, penetratina, péptidos hidrófobos como MTS, VP22, MAP, KALA, PpTG20,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

, . ARN monohebra inmunoestimulador complejado que comprende al menos un ARN (molécula) complejado con uno o más oligopéptidosno unidos al ARN de forma covalente, caracterizado porque la proporción nitrógeno/fosfato (ratio N/P) del al menos un ARN del ARN complejado con uno o más oligopéptidos está en el intervalo de 0, 5-50 y porque el oligopéptido tiene una longitud de 8 a 15 aminoácidos y tiene la siguiente fórmula empírica "

(Arg) ¡; (LYS) rn; (HiS) n; (Om) ., ; (xaah (fórmula 1)

donde"

• I + m + n + o + x = 8-15, yl, m, n u o, independientemente uno del otro, pueden ser cualquier número seleccionado entre O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14615, siempre que el contenido total de Arg, Lys, His y Om represente al menos un 50% de todos los aminoácidos del oligopéptido; y

• Xaa puede ser cualquier aminoácido seleccionado entre aminoácidos nativos o no nativos 15 excepto de Arg, Lys, His u Om; y

• x puede ser cualquier número seleccionado entre O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, siempre que el contenido total de Xaa no exceda el 50% de todos los aminoácidos del oligipéptido

2. ARN complejado según la reivindicación 1, caracterizado porque el al menos un ARN (molécula) es un ARNm.

3. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el oligopéptido tiene una longitud de 8 a 14, 8 a 13, 8 a 12, 69 a 12 ó 9 a 11 aminoácidos.

4. ARN complejado segúncualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el contenido total de Arg, Lys, His y Orn representa al menos el 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de todos los aminoácidos del oIigopéptido del ARN complejado

5. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque Xaa en la fórmu la empirica (Arg~; (Lys) rn; (His) rn; (Om) Q; (xaa) . se selecciona de entre aminoácidos que tienen una cadena lateral neutra, incluyendo aminoácidos que tienen una cadena lateral hidrófoba neutra y aminoácidos que tienen una cadena lateral polar neutra

6. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el oligopéptido de fórmula empírica (Arg) I; (LYS) rn; (His) n; (Om) o; (Xaa) . no comprende aminoácidos en uno o en ambos extremos terminales, que comprenden una cadena lateral ácida

7. ARN complejado segúncualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el oligopéptido de fórmu la empírica (Arg~; (LYS) m; (His) n; (Om) .:, ; (Xaa) . comprende aminoácidos neutros o básicos en uno o en ambos extremos terminales, o aminoácidos básicos en uno o en ambos extremos

terminales y al menos uno, preferentemente al menos dos, en especial al menos tres aminoácidos básicos en ambos extremos terminales

8. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el oligopéptido de fórmula empírica (Arg) I; (Lys) rn; (His) n; (Orn) o; (Xaa) x comprende un tramo de al menos 3 aminoácidos básicos contiguos dentro de su secuencia.

9. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el oligopéptido de fórmula empírica (Arg) I; (LYS) m; (His) n; (Om) .:, ; (Xaa) . comprende al menos 1, 2 ó 3 aminoácidos no catiórJicos en uno o ambos extremos terminales, seleccionándose preferentemente el aminoácido no catiónico de histidina.

10. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el almenos un

ARN (molécula) del ARN complejado es un ARNm, codificando el ARNm para una proteína o un péptido terapéuticamente activos, una proteina o péptido inmunoestimulador, un antígeno tumoral o un anticuerpo

11. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el ARN es un ARN modificado, en particular un ARN estabilizado, en comparación con el ARN tipo salvaje.

12. ARN complejado segúncualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porquela relación en masa entre el al menos un ARN (molécula) del ARN complejado y el uno o más oligopéptidos está

en un intervalo de 1 :100 a 1 :0, 5, o tiene un va lor de 1 :50 a 1:1 , 1 :100, 1 :90, 1 :80, 1 :70, 1 :60, 1 :50 ,

1:45, 1:40, 1:35, 1:30, 1:25, 1:20, 1:15, 1:10, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1 o 1:0, 5

13. ARN complejado según cua lquiera de las reivindicaciooes 1 a 11 , caracterizado porque la relaciórJ

molar entre el al menos un ARN (molécu la) del ARN complejado y el uno o más oligopéptidos está

5 en un intervalo de 1 :20.000 a 1 :500 o 1 :250, o en uninlervalo de 1 :10.000 a 1 :1.000, o tiene un va lor

de 1 :9.500 a 1 :9.000, 1 :8.500, 1 :8.000, 1 :7.500, 1 :7.000, 1 :6.500, 1 :6.000, 1 :5.500, 1:5.000, 1 :4.S00 ,

1 :4 .000, 1 :3.500, 1 :3.000, 1 :2.500, 1 :2.000 , 1 :1.500, 1 :1.000, 1 :500, 1 :450 , 1 :400, 1 :350, 1 :300 o

1:250

14. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , caracterizado porque la proporción

10 nitrógenolfosfato (ratio N/P) está en un intervalo de 0, 75-25.

15. ARN complejado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el

ol igopéptido se selecciona de entre el grupo consistente en:ArggHis3, HisJArggHis3,

TyrSerSerArggSerSerTyr, HisJArggSerSerTyr, (ArgLysHis) 4 , Tyr (ArgLysHis) zArg ;o deArgs, Argg,

ArglO, Arg ll, Arg l2, Argl 3, Argl4, Arg1 5 (SEO ID NOs: 1-B) ; LYS8, LyS9, LYS10, LYS 11, LYS I2, LYS I3, LYSI4,

15 LyS15 (SEO ID NOs: 9-1 6) ;Hisa, HiSg, His lO, His11, His12, Hisl3, His14, His15 (SEO ID NOs' 17-24) y

Oma, Omg, OrnlO, Om", Om'2, Omll, Om, 4, Orn '5 (SEO ID NOs.

2. 32)

16. ARN complejado según cua lquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el ARN

complejado se formu la como una composición farmacéutica.

 

Patentes similares o relacionadas:

Cápside, del 3 de Mayo de 2019, de UCL BUSINESS PLC: Una proteína de la cápside del AAV que tiene una secuencia de aminoácidos que: (i) tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3; o (ii) tiene al menos un 99 % de identidad […]

Composiciones, kits y métodos para presentación de antígenos in vitro, evaluación de eficacia de vacunas y evaluación de la inmunotoxicidad de productos biológicos y fármacos, del 1 de Mayo de 2019, de UNIVERSITY OF MIAMI: Método de evaluación de una respuesta de células T frente a una vacuna o un producto biológico, comprendiendo el método las etapas de: a) preparar o proporcionar […]

Modulación de BCL11A para el tratamiento de hemoglobinopatías, del 1 de Mayo de 2019, de THE CHILDREN'S MEDICAL CENTER CORPORATION: Una composición que comprende una célula progenitora hematopoyética que comprende un ácido nucleico que inhibe la expresión de BCL11A, en donde el ácido […]

Formulaciones parasiticidas inyectables de acción prolongada, del 30 de Abril de 2019, de MERIAL, INC.: Una formulación líquida inyectable de acción prolongada para combatir ectoparásitos y/o endoparásitos en un mamífero que comprende: (a) una cantidad […]

Vectores de terapia génica para la adrenoleucodistrofia y la adrenomieloneuropatía, del 25 de Abril de 2019, de Bluebird Bio, Inc: Vector lentiviral que comprende: (a) una LTR de VIH-1 izquierda (5'); (b) una señal de empaquetamiento Psi (Ψ ); (c) un tramo de polipurina […]

ARN que contiene nucleósidos modificados y métodos de uso del mismo, del 17 de Abril de 2019, de THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA: Un método no terapéutico para inducir a una célula de mamífero a producir una proteína recombinante, comprendiendo el método poner en contacto dicha célula […]

Anticuerpos anti-TNF, composiciones, métodos y usos, del 16 de Abril de 2019, de Janssen Biotech, Inc: anticuerpo específico para el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) que tiene tres CDRs de la cadena pesada y tres CDRs de la cadena ligera o un fragmento […]

Agente inductor de apoptosis, del 12 de Abril de 2019, de NITTO DENKO CORPORATION: Una composición para el uso en el tratamiento de cáncer debido a sobreexpresión de GST-π y mutación de KRAS, en la que la composición comprende como principios activos […]

Otras patentes de CUREVAC GMBH