ARNM DE ANTIGENO TUMORAL ESTABILIZADO CON UN CONTENIDO DE G/C AUMENTADO.

ARNm modificado que codifica como mínimo un péptido o un polipéptido antígeno tumoral,

caracterizado porque el contenido de G/C de la zona del ARNm modificado que codifica el péptido o el polipéptido es mayor que el contenido de G/C del campo de codificación del ARNm del tipo salvaje que codifica el péptido o el polipéptido, y porque la secuencia del aminoácido codificada permanece sin modificar frente al tipo salvaje

ARNm de antígeno tumoral estabilizado con un contenido de G/C aumentado.

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene un ARNm estabilizado por modificaciones de secuencia en el campo traducido y optimizado para la traducción, así como a este ARNm estabilizado. La composición farmacéutica según la invención es especialmente adecuada como vacuna.

La terapia genética y la vacunación genética son procedimientos médicos moleculares cuya aplicación en la terapia y la prevención de enfermedades tendrán considerables efectos sobre la práctica médica. Ambos procedimientos se basan en la introducción de ácidos nucleicos en las células o en tejidos del paciente, así como en el subsiguiente procesamiento de la información codificada por los ácidos nucleicos introducidos, es decir la expresión de los polipéptidos deseados.

El método habitual para los procedimientos existentes hasta la fecha en la terapia genética y la vacunación genética es la utilización de ADN para introducir la información genética requerida en la célula. En este contexto se han desarrollado diferentes procedimientos para la introducción de ADN en las células, por ejemplo transfección con fosfato cálcico, transfección con polipreno, fusión de protoplastos, electroporación, microinyección y lipofección, donde especialmente la lipofección resultó ser un procedimiento adecuado.

Otro método especialmente propuesto en los procedimientos de vacunación genética es la utilización de ADN-virus como vehículos para el ADN. Tales virus tienen la ventaja de que, debido a sus características infecciosas, se puede conseguir un coeficiente de transfección muy alto. Los virus utilizados se modifican genéticamente de manera que en la célula transfectada no se forman partículas infecciosas activas. Sin embargo, a pesar de esta medida de precaución, no se puede excluir un cierto riesgo de propagación incontrolada de los genes de efecto en la terapia génica así como los virales introducidos debido a posibles eventos de recombinación.

Normalmente, el ADN introducido en la célula se integra en cierta medida en el genoma de la célula transfectada. Por un lado, este fenómeno puede tener un efecto deseado, ya que se puede conseguir así una actividad de larga duración del ADN introducido. Por otro lado, la integración en el genoma trae consigo un considerable riesgo para la terapia genética. Así, por ejemplo, se puede producir una inserción del ADN incorporado en un gen intacto, lo que representa una mutación que obstaculiza la función del gen endógeno o incluso la anula por completo. Debido a tales eventos de integración se pueden anular, por un lado, sistemas enzimáticos vitales para la célula y, por otro lado, también existe el peligro de una transformación de la célula así modificada en un estado de degeneración cuando, debido a la integración del ADN extraño, se modifica un gen decisivo para la regulación del crecimiento celular. Por esta razón, cuando se utilizan ADN-virus como agentes terapéuticos genéticos y vacunas no se puede excluir un riesgo de desarrollo de cáncer. En este contexto también se ha de tener en cuenta que, para la expresión efectiva de los genes introducidos en la célula, los vehículos de ADN correspondientes también contienen un fuerte promotor o el promotor de CMV viral. La integración de tales promotores en el genoma de la célula tratada puede conducir a modificaciones no deseadas de la regulación de la expresión genética en la célula.

Otra desventaja de la utilización de ADN como agente terapéutico genético y vacuna es la inducción de anticuerpos patógenos anti-ADN en el paciente, provocando una reacción inmunológica posiblemente letal.

Al contrario que el ADN, la utilización de ARN como agente terapéutico genético o vacuna se puede considerar considerablemente más segura. En especial, el ARN no presenta el peligro de integrarse de forma estable en el genoma de la célula transfectada. Además, no son necesarias secuencias virales como promotores para una transcripción efectiva. Adicionalmente, el ARN se desintegra in vivo de forma considerablemente más sencilla. Quizás debido al período de semidesintegración relativamente corto del ARN frente al ADN en el sistema sanguíneo, no se han detectado hasta la fecha anticuerpos anti-ARN. Por esta razón, el ARN puede considerarse como una molécula opcional para los procedimientos de la terapia médica molecular.

No obstante, los procedimientos médicos que se basan en sistemas de expresión de ARN todavía requieren, antes de una aplicación más amplia, la solución de algunos problemas básicos. Uno de los problemas al utilizar el ARN es la transferencia segura, eficiente específicamente en cuanto a la célula o bien el tejido, del ácido nucleico. Debido a que normalmente el ARN resulta muy inestable en solución, con los procedimientos tradicionales que se utilizan para el ADN hasta la fecha el ARN no ha podido utilizarse o se ha utilizado con una gran ineficacia como agente terapéutico o vacuna.

En cuanto a la inestabilidad son responsables las enzimas de desintegración del ARN, las llamadas RNAsas (ribonucleasas). Incluso las impurezas más pequeñas de ribonucleasas bastan para desintegrar por completo el ARN en solución. La desintegración natural del ARNm en el citoplasma celular está sujeta a una regulación muy fina. A este respecto, se conocen diversos mecanismos. Así, para un ARNm funcional tiene una importancia decisiva la estructura terminal. En el extremo 5' se encuentra la llamada estructura "cap" (caperuza) (un nucleótido de guanosina modificado) y en el extremo 3' una secuencia de hasta 200 nucleótidos de adenosina (la llamada cola poli A). A través de estas estructuras se reconoce el ARN como ARNm y se regula la desintegración. Además, existen otros procesos que estabilizan o desestabilizan el ARN. Muchos de estos procesos todavía no son conocidos, sin embargo, con frecuencia parece decisivo para ello una interacción entre el ARN y las proteínas. Por ejemplo, se describió hace poco un "mRNA-Surveillance-System" (sistema de control de ARNm) (Hellerin y Parker, Amun. Rev. Genet 1999, 33: 229 a 260) en el que se conocen, debido a determinadas interacciones de proteínas "feedback" (retroalimentación) en el citosol, ARNm incompletos o "nonsense" (sin sentido) a los que se proporciona acceso para la desintegración, donde una parte principal de este proceso es llevado a cabo por exonucleasas.

En la técnica actual se han propuesto algunas medidas para aumentar la estabilidad del ARN y, por tanto, hacer posible su utilización como sustancia terapéutica genética o como vacuna de ARN.

En este contexto, la WO 98/34640 describe moléculas de ADN, pero sólo sintéticas, que codifican HIV gag y modificaciones de HIV gag. Las moléculas dadas a conocer en la WO 98/34640 se pueden utilizar como vacunas de polinucleótido que posibilitan una profilaxis inmunológica efectiva contra el HIV por estimulación de anticuerpos neutralizadores e inmunidad por mediación celular. Sin embargo, la WO 98/34640 no describe ningún tipo de aumento o maximización del contenido de G/C de las moléculas de ADN sintéticas codificadoras, ni ninguna molécula de ARNm modificada y utilizada en este sentido.

La WO 97/48370 también describe moléculas de ADN sintéticas que codifican un péptido o proteína, en particular HIV env y también modificaciones de HIV env. Pero la WO 97/48370 tampoco describe ningún tipo de aumento o maximización del contenido de G/C de las moléculas de ADN sintéticas codificadoras, ni ninguna modificación de las moléculas de ARNm utilizadas en este sentido.

En la EP-A-1083232 se propone para solución del problema arriba enunciado de la inestabilidad del ARN ex vivo, un procedimiento para la introducción de ARN, especialmente ARNm, en células y organismos en los que el ARN existe en forma de un complejo con una proteína o un péptido catiónico. También se da a conocer la utilización de estos complejos para la terapia contra el cáncer, en cuyo caso el ARNm codifica antígenos tumorales.

La WO 99/14346 describe otros procedimientos para la estabilización del ARNm. En particular, se proponen modificaciones del ARN que estabilizan las especies de ARNm frente a la desintegración por las RNAsas. Tales modificaciones afectan, por un lado, a la estabilización por modificaciones de secuencia, especialmente reducción del contenido de C y/o U, mediante la eliminación o sustitución de bases. Por otro lado, se proponen modificaciones químicas, en especial la utilización de análogos...

1. ARNm modificado que codifica como mínimo un péptido o un polipéptido antígeno tumoral, caracterizado porque el contenido de G/C de la zona del ARNm modificado que codifica el péptido o el polipéptido es mayor que el contenido de G/C del campo de codificación del ARNm del tipo salvaje que codifica el péptido o el polipéptido, y porque la secuencia del aminoácido codificada permanece sin modificar frente al tipo salvaje.

2. ARNm modificado según la reivindicación 1, caracterizado porque el contenido de G/C de la zona del ARNm modificado que codifica el péptido o el polipéptido es como mínimo un 7%, preferentemente como mínimo un 15%, mayor que el contenido de G/C del campo de codificación del ARNm del tipo salvaje que codifica el péptido o el polipéptido.

3. ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el ARNm modificado presenta una estructura cap en 5' y/o una cola poliA de como mínimo 70 nucleótidos y/o un IRES y/o una secuencia de estabilización de 5' y/o una secuencia de estabilización de 3'.

4. ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el ARNm modificado tiene como mínimo un nucleótido análogo de procedencia natural.

5. ARNm modificado según la reivindicación 4, caracterizado porque el análogo se selecciona de entre el grupo consistente en fosforotioatos, fosforamidatos, nucleótidos de péptidos, metilfosfonatos, 7-desazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina.

6. ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ARNm codifica un antígeno de superficie específico de tumores.

7. ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el ARNm modificado codifica un antígeno tumoral seleccionado de entre el grupo consistente en 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, ß-catenina/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R1701, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (o hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MC1R, Miosina/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NY-ESO-1, p190 minor bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, PSA, PSM, RAGE, RU1 ó RU2, SAGE, SART-1 ó SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2 y WT1.

8. ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el polipéptido es un poliepitopo de antígenos de tumores.

9. ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el ARNm codifica, además, como mínimo una citoquina.

10. ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el ARNm está asociado o unido a una proteína o un péptido catiónico.

11. ARNm modificado según la reivindicación 10, caracterizado porque la proteína o el péptido catiónico se selecciona de entre el grupo consistente en protamina, poli-L-lisina e histonas.

12. Composición farmacéutica caracterizada porque contiene el ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 11 junto con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente compatible.

13. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, caracterizada porque contiene como mínimo un adyuvante que estimula la respuesta inmunológica.

14. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 12 ó 13, que contiene como mínimo además una citoquina.

15. Utilización de una composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 12 a 14 o de un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de una vacuna para la inoculación contra el cáncer.

16. Utilización de una composición farmacéutica según las reivindicaciones 12 a 14 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de melanomas, carcinomas del colon, linfomas, carcinomas de pulmón de células pequeñas, sarcomas ó blastomas.