ARNM ESTABILIZADO CON UN CONTENIDO DE G/C AUMENTADO PARA LA TERAPIA GENETICA.

Utilización de un ARNm modificado que codifica como mínimo un péptido o un polipéptido biológicamente efectivo,

caracterizada porque el contenido de G/C de la zona del ARNm modificado que codifica el péptido o el polipéptido es mayor que el contenido de G/C de la zona del ARNm del tipo salvaje que codifica el péptido o el polipéptido y porque la secuencia codificada de aminoácidos permanece sin modificar frente al tipo salvaje, para la producción de un medicamento para la terapia genética

ARNm estabilizado con un contenido de G/C aumentado para la terapia genética.

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene un ARNm estabilizado por modificaciones de secuencia en el campo traducido y optimizado para la traducción, o al ARNm modificado correspondiente. La composición farmacéutica según la invención es adecuada como sustancia terapéutica para la terapia genética, en particular para la regeneración de tejidos.

La terapia genética y la vacunación genética son procedimientos médicos moleculares cuya aplicación en la terapia y la prevención de enfermedades tendrán considerables efectos en la práctica médica. Ambos procedimientos se basan en la introducción de ácidos nucleicos en células o en tejidos del paciente, así como subsiguiente procesamiento de la información codificada por los ácidos nucleicos introducidos, es decir la expresión de los polipéptidos deseados.

El método habitual de los procedimientos existentes hasta la fecha en la terapia genética y la vacunación genética es la utilización de ADN para introducir la información genética requerida en la célula. En este contexto se han desarrollado diferentes procedimientos para la introducción de ADN en las células, por ejemplo la transfección de fosfato cálcico, la transfección de polipreno, la fusión de protoplastos, electroporación, microinyección y lipofección, donde especialmente la lipofección resultó ser un procedimiento adecuado.

Otro procedimiento que se ha propuesto especialmente en procedimientos de vacunación genética es la utilización de virus de ADN como vehículos para el ADN. Tales virus tienen la ventaja de que, debido a sus características infecciosas, se puede conseguir un coeficiente de transfección muy alto. Los virus utilizados se modifican genéticamente de manera que en la célula transfectada no se forman partículas infecciosas activas. Sin embargo, a pesar de esta medida de precaución no se puede excluir un cierto riesgo de propagación incontrolada de los genes de efecto terapéutico genético así como virales debido a posibles incidencias de recombinación.

Normalmente, el ADN introducido en la célula se integra en cierta medida en el genoma de la célula transfectada. Por un lado, este fenómeno puede tener un efecto deseado, ya que se puede conseguir así una actividad de larga duración del ADN introducido. Por otro lado, la integración en el genoma trae consigo un considerable riesgo para la terapia genética. Así, por ejemplo, se puede producir una inserción del ADN incorporado en un gen intacto, lo que representa una mutación que obstaculiza la función del gen endógeno o incluso la anula por completo. Debido a tales incidencias de integración se pueden anular, por un lado, sistemas enzimáticos vitales para la célula y, por otro lado, también existe el peligro de una transformación de la célula así modificada en un estado de degeneración cuando, debido a la integración del ADN extraño, se modifica un gen decisivo para la regulación del crecimiento celular. Por esta razón, cuando se utilizan virus de ADN como agentes terapéuticos genéticos y vacunas no se puede excluir un cierto riesgo de formación de cáncer. En este contexto también se ha de tener en cuenta que, para la expresión efectiva de los genes introducidos en la célula, los vehículos de ADN correspondientes también contienen un promotor fuerte o el promotor de CMV viral. La integración de tales promotores en el genoma de la célula tratada puede conducir a modificaciones no deseadas de la regulación de la expresión genética en la célula.

Otra desventaja de la utilización del ADN como agente terapéutico genético y vacuna es la inducción de anticuerpos anti ADN patógenos en el paciente, provocando una reacción inmunológica posiblemente letal.

Al contrario que el ADN, la utilización de ARN como agente terapéutico genético o vacuna se puede considerar considerablemente más segura. Especialmente, el ARN no presenta el peligro de integrarse de forma estable en el genoma de la célula transfectada. Además, no son necesarias secuencias virales como promotores para una traducción efectiva. Adicionalmente, el ARN se desintegra in vivo de forma considerablemente más sencilla. Quizás debido al período de semidesintegración relativamente corto del ARN frente al ADN en el sistema sanguíneo, no se han detectado hasta la fecha anticuerpos de anti ARN. Por esta razón, el ARN puede considerarse la molécula opcional para procedimientos de terapia médica molecular.

No obstante, los procedimientos médicos que se basan en sistemas de expresión de ARN todavía requieren, antes de una aplicación más amplia, la solución de algunos problemas básicos. Uno de los problemas que surgen al utilizar el ARN es la transferencia segura, eficiente específicamente en cuanto a la célula o el tejido del ácido nucleico. Debido a que el ARN normalmente resulta muy inestable en forma de solución, por los procedimientos tradicionales que se utilizan para el ADN, hasta la fecha el ARN no ha podido utilizarse o se ha utilizado con una poca eficacia como agente terapéutico o vacuna.

En cuanto a la inestabilidad, son responsables las enzimas de desintegración de ARN, las denominadas RNasas (ribonucleasas). Incluso las impurezas más pequeñas de ribonucleasas bastan para desintegrar por completo el ARN en solución. La desintegración natural del ARNm en el citoplasma celular está sujeta a una regulación muy fina. En cuanto a esto se conocen varios mecanismos. Así, para un ARNm funcional tiene una importancia decisiva la estructura terminal. En el extremo 5' se encuentra la denominada estructura "cap" (caperuza) (un nucleótido de guanosina modificado) y en el extremo 3' una secuencia de hasta 200 nucleótidos de adenosina (la llamada cola poli A). Gracias a estas estructuras se reconoce el ARN como ARNm y se regula la desintegración. Además, existen otros procesos que estabilizan o desestabilizan el ARN. Muchos de estos procesos todavía no son conocidos, sin embargo, con frecuencia parece ser decisiva una interacción entre el ARN y las proteínas. Por ejemplo, se describió recientemente un "mRNA-Surveillance-System" (sistema de control del ARNm) (Hellerin y Parker, Amun. Rev. Genet 1999, 33: 229 a 260) en el que se conocen, debido a determinadas interacciones de proteínas de "feedback" (retroalimentación) del citosol, ARNm incompletos o "nonsense" (sin sentido) a los que se les permite el acceso para la desintegración, donde una parte principal de este proceso se lleva a cabo por exonucleasas.

En la técnica actual se han propuesto algunas medidas para aumentar la estabilidad del ARN y, por tanto, hacer posible su utilización como sustancia terapéutica genética o como vacuna de ARN.

En este contexto, la WO 98/34640 describe moléculas de ADN, pero sólo sintéticas, que codifican HIV gag y modificaciones de HIV gag. Las moléculas dadas a conocer en la WO 98/34640 se pueden utilizar como vacunas de polinucleótido que posibilitan una profilaxis inmunológica efectiva contra HIV por estimulación de los anticuerpos neutralizadores e inmunidad por mediación celular. Sin embargo, la WO 98/34640 no describe ningún tipo de aumento o maximización del contenido en G/C de las moléculas de ADN sintéticas codificadoras, ni ninguna molécula de ARNm modificada ni utilizada en este contexto.

La WO 97/48370 también describe moléculas de ADN sintéticas que codifican un péptido o proteína, en particular HIV env y también modificaciones de HIV env. Pero la WO 97/48370 tampoco describe ningún tipo de aumento o maximización del contenido en G/C de las moléculas de ADN sintéticas codificadoras, ni ninguna modificación de las moléculas de ARNm utilizadas en este contexto.

En la EP-A-1083232 se propone para solución del problema arriba enunciado de la inestabilidad del ARN ex vivo, un procedimiento para la introducción de ARN, especialmente ARNm, en células y organismos en los que el ARN existe en forma de complejo con una proteína o un péptido catiónico. La EP 1083232 también describe la utilización de estos complejos para el tratamiento de enfermedades que se basan en al menos un defecto genético. De este modo, a través del complejo de ARNm se proporciona la información genética correcta, que no está presente correspondientemente en el gen defectuoso o que falta en el paciente.

La WO 99/14346 describe otros procedimientos para la estabilización del ARNm. Especialmente se proponen modificaciones del ARNm que estabilizan las especies de ARNm frente a la desintegración por las RNasas....

1. Utilización de un ARNm modificado que codifica como mínimo un péptido o un polipéptido biológicamente efectivo, caracterizada porque el contenido de G/C de la zona del ARNm modificado que codifica el péptido o el polipéptido es mayor que el contenido de G/C de la zona del ARNm del tipo salvaje que codifica el péptido o el polipéptido y porque la secuencia codificada de aminoácidos permanece sin modificar frente al tipo salvaje, para la producción de un medicamento para la terapia genética.

2. Utilización de un ARNm modificado según la reivindicación 1, caracterizada porque el contenido de G/C de la zona del ARNm modificado que codifica el péptido o el polipéptido es como mínimo un 7%, preferentemente como mínimo un 15% mayor que el contenido de G/C del campo de codificación del ARNm del tipo salvaje que codifica el péptido o el polipéptido.

3. Utilización de un ARNm modificado según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la zona del ARNm modificado que codifica el péptido o el polipéptido está modificada de tal manera que resulta un contenido máximo de G/C en conexión con los codones que codifican ARNt's relativamente frecuentes.

4. Utilización de un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el ARNm modificado presenta una estructura cap en 5' y/o una cola poliA de como mínimo 70 nucleótidos y/o un IRES y/o una secuencia de estabilización 5' y/o una secuencia de estabilización 3'.

5. Utilización de un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el ARNm modificado tiene como mínimo un nucleótido análogo de procedencia natural.

6. Utilización de un ARNm modificado según la reivindicación 5, caracterizada porque el análogo se selecciona de entre el grupo compuesto por fosforotioatos, fosforamidatos, nucleótidos peptídicos, metilfosfonatos, 7-desazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina.

7. Utilización de un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el ARNm codifica un polipéptido que en el paciente a tratar no se forma o solamente se forma de manera insuficiente o defectuosa.

8. Utilización de un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el ARNm modificado codifica distrofina, enzimas que están ausentes o defectuosas en caso de enfermedades metabólicas, o enzimas que participan en la síntesis de neurotransmisores.

9. Utilización de un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el ARNm codifica un péptido o una proteína que se une a receptores de superficie celulares.

10. Utilización de un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 7 ó 9, caracterizada porque el ARNm codifica factores de crecimiento u hormonas de crecimiento.

11. Utilización de un ARNm modificado según la reivindicación 7 ó 9, caracterizada porque el ARNm codifica activador plasminógeno tisular, insulina, interferones, GM-CFS, eritropoyetina, tirosina-hidroxilasa, DOPA-descarboxilasa o a-1-antitripsina.

12. Utilización de un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el ARNm está asociado o enlazado con una proteína o un péptido catiónico, en particular protamina, poli-L-lisina o histonas.

13. Utilización de un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque el ARNm codifica además como mínimo una citoquina.

14. Utilización de un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 13, en combinación con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente compatible.

15. Utilización de un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 14 para la regeneración de tejidos o para el tratamiento de enfermedades degenerativas, en particular enfermedades neurodegenerativas.

16. Utilización de un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 14 para la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson o la artrosis.

17. Utilización de un ARNm modificado según la reivindicación 15 ó 16, caracterizada porque el ARNm codifica factores de crecimiento de la familia TGF-ß.

18. Utilización de un ARNm modificado según la reivindicación 15 ó 16, caracterizada porque el ARNm codifica EGF, FGF, PDGF, BMP, GDNF, BDNF, GDF y factores neurotróficos, por ejemplo NGF o neutrofinas.

19. ARNm modificado que codifica como mínimo un péptido o un polipéptido biológicamente efectivo que en el paciente a tratar no se forma o solamente se forma de manera insuficiente o defectuosa, caracterizado porque el contenido de G/C de la zona del ARNm modificado que codifica el péptido o el polipéptido es mayor que el contenido de G/C de la zona del ARNm del tipo salvaje que codifica el péptido o polipéptido y la secuencia codificada de aminoácidos permanece sin modificar frente al tipo salvaje.

20. ARNm modificado según la reivindicación 19, que codifica enzimas que están ausentes o defectuosas en caso de enfermedades metabólicas, o enzimas que participan en la síntesis de neurotransmisores.

21. ARNm modificado según la reivindicación 19, que codifica receptores de superficie celulares.

22. ARNm modificado según la reivindicación 19, caracterizado porque codifica proteínas que actúan extracelularmente o que se enlazan en receptores de superficie celulares, seleccionados entre el grupo consistente en activador plasminógeno tisular, hormonas de crecimiento, insulina, interferones, factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos, factores de crecimiento y eritropoyetina.

23. Composición farmacéutica que contiene un ARNm modificado según una de las reivindicaciones 19 a 22, en unión con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente compatible.