ARNm ESTABILIZADO CON UN CONTENIDO DE G/C AUMENTADO QUE CODIFICA PARA UN ANTÍGENO VIRAL.

ARNm modificado que codifica como mínimo un péptido o un polipéptido viral antígeno,

caracterizado porque el contenido de G/C del campo del ARNm modificado que codifica el péptido o polipéptido es mayor que el contenido de G/C del campo de codificación del ARNm del tipo salvaje que codifica el péptido o polipéptido, y la secuencia del aminoácido codificada permanece sin modificar frente al tipo salvaje

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E07015835.

Solicitante: CUREVAC GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: PAUL-EHRLICH-STRASSE 15 72076 TUBINGEN ALEMANIA.

Inventor/es: HOERR, INGMAR, PASCOLO, STEVE, VON DER MULBE,FLORIAN.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 5 de Junio de 2002.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K38/00 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00).
  • A61K38/19 A61K […] › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Citoquinas; Linfoquinas; Interferones.
  • A61K39/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
  • A61K48/00D
  • C07K14/11 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Orthomyxoviridae, p. ej. virus de la influenza.
  • C12N15/67 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Métodos generales para favorecer la expresión.

Clasificación PCT:

  • A61K39/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
  • A61K39/145 A61K […] › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Orthomyxoviridae, p. ej. virus de la influenza.
  • A61K48/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
  • A61P31/16 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES.A61P 31/00 Antiinfecciosos, es decir antibióticos, antisépticos, quimioterápicos. › para virus de la gripe o rinovirus.
  • A61P35/04 A61P […] › A61P 35/00 Agentes antineoplásicos. › específicos para la metástasis.
  • C07K14/11 C07K 14/00 […] › Orthomyxoviridae, p. ej. virus de la influenza.
  • C07K14/47 C07K 14/00 […] › de mamíferos.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Finlandia, Chipre.

PDF original: ES-2356934_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene un ARNm estabilizado por modificaciones de secuencia en el campo traducido y optimizado para la traducción. La composición farmacéutica según la invención es especialmente adecuada como vacuna contra enfermedades infecciosas virales. Además, se describe 5 un procedimiento para la determinación de modificaciones de secuencia que sirven para la estabilización y la optimización de la traducción de ARNm.

La terapia genética y la vacunación genética son procedimientos médicos moleculares cuya aplicación en la terapia y la prevención de enfermedades tendrá considerables efectos sobre la práctica médica. Ambos procedimientos se basan en la introducción de ácidos nucleicos en células o en tejidos del paciente, así como en el subsiguiente 10 procesamiento de la información codificada por los ácidos nucleicos introducidos, es decir la expresión de los polipéptidos deseados.

El método habitual de los procedimientos existentes hasta la fecha en la terapia genética y la vacunación genética es la utilización de ADN para introducir la información genética requerida en la célula. En este contexto se han desarrollado diferentes procedimientos para la introducción de ADN en células, por ejemplo transfección de fosfato 15 cálcico, transfección de polipreno, fusión de protoplastos, electroporación, microinyección y lipofección, donde especialmente la lipofección resultó ser un procedimiento adecuado.

Otro procedimiento que se ha propuesto especialmente en procedimientos de vacunación genética es la utilización de virus de ADN como vehículos para el ADN. Tales virus tienen la ventaja de que, debido a sus características infecciosas, se puede conseguir un coeficiente de transfección muy alto. Los virus utilizados se modifican 20 genéticamente de manera que, en la célula transfectada, no se forman partículas infecciosas activas. Sin embargo, a pesar de esta medida de precaución, no se puede excluir un cierto riesgo de propagación incontrolada de los genes tanto de efecto terapéutico genético como virales debido a posibles incidencias en la recombinación.

Normalmente, el ADN introducido en la célula se integra en cierta medida en el genoma de la célula transfectada. Por un lado, este fenómeno puede tener un efecto deseado, ya que se puede conseguir así una actividad 25 de larga duración del ADN introducido. Por otro lado, la integración en el genoma trae consigo un considerable riesgo en la terapia genética. Así, por ejemplo, se puede producir una inserción del ADN incorporado en un gen intacto, lo que representa una mutación que obstaculiza la función del gen endógeno o, incluso, la anula por completo. Debido a tales incidencias de integración, se pueden anular, por un lado, sistemas enzimáticos vitales para la célula y, por otro lado, también existe el peligro de una transformación de la célula así modificada en un estado de degeneración si, por la 30 integración del ADN extraño, se modifica un gen decisivo para la regulación del crecimiento celular. Por esta razón, cuando se emplean virus de ADN como agentes terapéuticos genéticos y vacunas no se puede excluir un cierto riesgo de formación de cáncer. En este contexto también se ha de tener en cuenta que para la expresión efectiva de los genes introducidos en la célula, los vehículos de ADN correspondientes, también contienen un fuerte promotor, por ejemplo el promotor de CMV viral. La integración de tales promotores en el genoma de la célula tratada puede conducir a 35 modificaciones no deseadas de la regulación de la expresión genética en la célula.

Otra desventaja de la utilización del ADN como agente terapéutico genético y vacuna es la inducción de anticuerpos anti ADN patógenos en el paciente, provocando una reacción inmunológica posiblemente letal.

Al contrario que con el ADN, la utilización de ARN como agente terapéutico genético o vacuna se puede considerar considerablemente más segura. Especialmente, el ARN no presenta el peligro de integrarse de forma estable 40 en el genoma de la célula transfectada. Además, no son necesarias secuencias virales como promotores para una transcripción efectiva. Adicionalmente, el ARN se desintegra in vivo de forma considerablemente más sencilla. Quizás debido al período de semidesintegración relativamente corto del ARN frente al ADN en el sistema sanguíneo, no se han detectado hasta la fecha anticuerpos de anti ARN. Por esta razón, el ARN puede considerarse la mejor opción de molécula para procedimientos de terapia médica molecular. 45

No obstante, los procedimientos médicos que se basan en sistemas de expresión de ARN todavía requieren, antes de una aplicación más amplia, la solución de algunos problemas básicos. Uno de los problemas de utilizar ARN es la transferencia segura, eficiente específicamente en cuanto a la célula o el tejido, del ácido nucleico. Debido a que el ARN normalmente es muy inestable en forma de solución, por los procedimientos tradicionales que se utilizan para el ADN, hasta la fecha el ARN no ha podido utilizarse o se ha utilizado con escasa eficacia como agente terapéutico o 50 vacuna.

En cuanto a la inestabilidad son responsables enzimas de desintegración de ARN, las denominadas RNasas (ribonuleasas). Incluso las impurezas más pequeñas de ribonucleasas bastan para desintegrar por completo el ARN en solución. La desintegración natural del ARNm en el citoplasma celular está sujeta a una regulación muy fina. En este contexto, se conocen diversos mecanismos. Así, para un ARNm funcional tiene una importancia decisiva la estructura 55 terminal. En el extremo 5' se encuentra la llamada estructura "cap" (caperuza) (un nucleótido de guanosina modificado) y en el extremo 3' una secuencia de hasta 100 nucleótidos de adenosina (la llamada cola poli A). A través de estas estructuras se reconoce el ARN como ARNm y se regula la desintegración. Además, existen otros procesos que

estabilizan o desestabilizan el ARN. Muchos de estos procesos todavía no son conocidos, sin embargo, con frecuencia parece decisiva para ello una interacción entre el ARN y las proteínas. Por ejemplo, se describió recientemente un "mRNA-Surveillance-System" (sistema de control de ARNm) (Hellerin y Parker, Amun. Rev. Genet. 1999, 33: 229 a 260) en el que se conocen, debido a determinadas interacciones de proteínas de "feedback" (retroalimentación) en el citosol, ARNm incompletos o "nonsense" (sin sentido) a los que se proporciona acceso para la desintegración, donde una parte 5 principal de este proceso la llevan a cabo exonucleasas.

En la técnica actual se han propuesto algunas medidas para aumentar la estabilidad del ARN y, por ello, hacer posible su utilización como sustancia terapéutica genética o vacuna de ARN.

En la EP-A-1083232 se propone para la solución del problema arriba enunciado de la inestabilidad del ARN ex vivo un procedimiento para la introducción de ARN, especialmente ARNm, en células y organismos en los que el ARN 10 existe en forma de un complejo con una proteína o un péptido catiónico.

La WO 99/14346 describe otros procedimientos para la estabilización de ARNm. Especialmente se proponen modificaciones de ARNm que estabilizan las especies de ARNm frente a la desintegración por las RNasas. Tales modificaciones afectan, por un lado, a la estabilización por modificaciones de secuencia, especialmente reducción del contenido de C y/o U mediante la eliminación o sustitución de bases. Por otro lado, se proponen modificaciones 15 químicas, especialmente la utilización de análogos de nucleótidos, así como grupos de bloqueo de 5' y 3', una mayor longitud de la cola de poli-A, así como la formación de complejos de ARNm con medios de estabilización y combinaciones de las medidas indicadas.

En las patentes de Estados Unidos US 5.580.859 y US 6.214.804 se describen, entre otros dentro del marco de la "terapia genética transitoria" (TGT), vacunas y sustancias terapéuticas de ARNm. Se describen diferentes medidas 20 para aumentar la eficacia de la traducción y la estabilidad del ARNm, medidas que se refieren, sobre todo, a regiones de secuencias no traducidas.

Bieler y Wagner (en: Schleef (Eds.), Plasmids for Therapy and Vaccination, capítulo 9, páginas 147 a 168, Wiley-VCH, Weinheim, 2001) informan sobre la utilización de genes sintéticos en conexión con métodos terapéuticos genéticos utilizando vacunas de ADN y vectores lentivirales. Se describe la construcción... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. ARNm modificado que codifica como mínimo un péptido o un polipéptido viral antígeno, caracterizado porque el contenido de G/C del campo del ARNm modificado que codifica el péptido o polipéptido es mayor que el contenido de G/C del campo de codificación del ARNm del tipo salvaje que codifica el péptido o polipéptido, y la secuencia del aminoácido codificada permanece sin modificar frente al tipo salvaje. 5

2. ARNm modificado según la reivindicación 1, caracterizado porque el contenido de G/C del campo del ARNm modificado que codifica el péptido o polipéptido es como mínimo un 7%, preferentemente como mínimo un 15%, mayor que el contenido de G/C del campo de codificación del ARNm del tipo salvaje que codifica el péptido o polipéptido.

3. ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el ARNm modificado presenta 10 una estructura cap en 5' y/o una cola poliA de como mínimo 70 nucleótidos y/o un IRES y/o una secuencia de estabilización de 5' y/o una secuencia de estabilización de 3'.

4. ARNm modificado según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el ARNm modificado tiene como mínimo un nucleótido análogo de procedencia natural.

5. ARNm modificado según la reivindicación 4, caracterizado porque el análogo se selecciona de entre el grupo 15 compuesto por fosfotioatos, fosfoamidatos, nucleótidos peptídicos, metilfosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina.

6. ARNm modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el antígeno viral proviene de la forma segregada de un antígeno de superficie.

7. ARNm modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ARNm codifica un 20 antígeno de superficie de gérmenes virales patógenos.

8. ARNm modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el ARNm está asociado o unido a una proteína o un péptido catiónico.

9. ARNm modificado según la reivindicación 8, caracterizado porque la proteína o el péptido catiónico se selecciona de entre el grupo consistente en protamina, poli-L-lisina e histonas. 25

10. ARNm modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el polipéptido es un poliepitope de antígenos virales.

11. ARNm modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el ARNm modificado es un ARNm multicistrónico.

12. ARNm modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el ARNm codifica 30 además al menos una citoquina.

13. ARNm modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el ARN multicistrónico presenta más de una secuencia IRES, seleccionándose las secuencias IRES en especial entre picornavirus (por ejemplo FMDV), virus de la peste (CFFV), virus de la poliomelitis (PV), virus de encefalo-miocarditis (ECMV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la hepatitis C (HCV), virus clásicos de la fiebre porcina (CSFV), virus de 35 leucoma murino (MLV), virus de la inmunodeficiencia del simio (SIV) o virus de la parálisis de cricket (CrPV).

14. Composición farmacéutica caracterizada porque contiene el ARNm modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 junto con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente compatible.

15. Composición farmacéutica según la reivindicación 14, caracterizada porque contiene como mínimo un adyuvante que estimula la reacción inmunológica. 40

16. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, que contiene como mínimo además una citoquina.

17. Utilización de una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 o de un ARNm modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la preparación de una vacuna para la vacunación contra enfermedades infecciosas virales. 45

18. Utilización de una composición farmacéutica según la reivindicación 17 para la preparación de una vacuna para la vacunación contra SIDA, hepatitis A, B ó C, herpes, herpes Zoster, rubéola, dengue, enfermedades infecciosas hemorrágicas, fiebre amarilla y gripe.


 

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