Conjugados polietilenglicol/péptidos unidos por disulfuro para la transfección de ácidos nucleicos.

Molécula portadora polimérica de fórmula (I):

L-P1-S-[S-P2-S]n-S-P3-L

donde,

P1 y P3 son idénticos o diferentes y representan una cadena polimérica hidrófila lineal o ramificada, teniendo cada P1 y P3 al menos una parte -SH capaz de formar un enlace disulfuro bajo condensación con un componente P2, seleccionándose la cadena polimérica hidrófila ramificada o lineal independientemente de entre polietilenglicol (PEG), poli-N-(2-hidroxipropil)metacrilamida, poli- 2-(metacriloiloxi)etilfosforilcolinas, poli(hidroxialquil-L-asparagina), poli(2-(metacriloiloxi)etil-fosforilcolina), hidroxietilalmidón o poli(hidroxialquil-L-glutamina), donde la cadena polimérica hidrófila tiene un peso molecular de 1 kDa a de 100 kDa, P2 es un péptido o proteína catiónico o policatiónico, y tiene una longitud de 3 a de 100 aminoácidos, oes un polímero catiónico o policatiónico con un peso molecular de 0,5 kDa a kDa, teniendo cada P2 al menos dos partes -SH capaces de formar un enlace disulfuro bajo condensación con componentes P2 adicionales o con componentes P1 y/o P3;

-S-S- es un enlace disulfuro;

L es un ligando opcional que puede o no estar presente, y que puede seleccionarse independientemente de RGD, transferrina, folato, un péptido señal o una secuencia señal, una señal o secuencia de localización, una señal o secuencia de localización nuclear (NLS), un anticuerpo, un péptido de penetración celular, TAT, un ligando de un receptor, citoquinas, hormonas, factores de crecimiento, moléculas pequeñas, carbohidratos, manosa, galactosa, ligandos sintéticos, agonistas de molécula pequeña, inhibidores o antagonistas de receptores, oanálogos de peptidomimético RGD; y

n es un entero, seleccionado de un intervalo de 1 a 50, de preferencia en un intervalo de 1, 2, 3, 4 ó 5 a 10, muy preferiblemente en un intervalo de 1, 2, 3 ó 4 a 9 y donde cualquiera de los componentes P2 pueden ser iguales o diferentes, y donde al menos un componente aminoácido adicional (AA)x está presente o ausente en la molécula portadora polimérica, siendo AA un aminoácido y x un entero seleccionado de un rango de 1 a 100 y donde, si el componente (AA)x está presente, el al menos un componente aminoácido adicional (AA)xes un enlazador entre los componentes P1 o P3 y el componente L, o, si el componente L está ausente, el al menos un componente aminoácido adicional (AA)x es una parte de los componentes P1 o P3.

Conjugados polietilenglicol/peptidos unidos por disulfuro para la transfección de ácidos nucleicos La presente invención se dirige a moléculas portadoras poliméricas de acuerdo con la fórmula genérica (I) y a variaciones de la misma de acuerdo con las reivindicaciones, que permiten la transfección eficiente de ácidos nucleicos al interior de células in vivo e in vitro, a un complejo de carga portador polimérico formado por un ácido nucleico y la molécula portadora polimérica de la invención, pero también a métodos de preparación de esta molécula portadora polimérica y del complejo de carga portador polimérico. La presente invención proporciona también dicha molécula portadora polimérica y dicho complejo de carga portador polimérico para su uso comoun medicamento, para su uso en el tratamiento de diversas enfermedades, y en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de tales enfermedades.

Actualmente diversas enfermedades requieren un tratamiento que implica la administración de medicamentos a base de péptidos, proteínas y ácidos nucleicos, particularmente la transfección de ácidos nucleicos en células o tejidos. Con frecuencia, el potencial terapéutico completo de los medicamentosbasados en péptidos, proteínas y ácidos nucleicos está comprometido por su capacidad limitada para cruzar la membrana plasmática de las células de mamífero, lo que resulta en un acceso celular deficiente y una eficacia terapéutica inadecuada. Actualmente este obstáculo representa un gran reto para el desarrollo biomédico y el éxito comercial de muchos biofarmacéuticos (véase, por ejemplo, Foerg y Merkle, Journal of Pharmaceutical Sciences, publicado en línea en www.interscience.wiley.com, 2008, 97 (1) : 144-62) .

Para algunas enfermedades o trastornos, se han desarrollado enfoques terapéuticos génicos como una forma específica de estos tratamientos. Estos tratamientos en general utilizan la transfección de ácidos nucleicos o genes en células o tejidos, mientras que los enfoques terapéuticos génicos implican además la inserción de uno o más de estos ácidos nucleicos o genes en células y tejidos de un individuo para tratar una enfermedad, por ejemplo enfermedades hereditarias, en las cuales un alelo mutante defectuoso es reemplazado por uno funcional.

Sin embargo, la transferencia o inserción de uno o más de estos ácidos nucleicos o genes en las células de un individuo aún representa un gran reto actualmente y es absolutamente necesaria para asegurar un efecto terapéutico adecuado de los medicamentos basados en ácidos nucleicos, particularmente en el campo de terapia génica.

Para lograr una transferencia exitosa de los ácidos nucleicos o genes en las células de un individuo, deben eliminarse diferentes obstáculos. Típicamente, el transporte de los ácidos nucleicos se produce por la asociación del ácido nucleico a la membrana celular y posterior absorción por los endosomas. En los endosomas, los ácidos nucleicos introducidos están separados del citosol. Debido a que la expresión se produce en el citosol, estos ácidos nucleicos tienen que salirdel citosol. Si los ácidos nucleicos no logran salirdel citosol, o bien el endosoma se fusiona con el lisosoma llevando a una degradación de su contenido o bien el endosoma se fusiona con la membrana celular llevando a un retorno de su contenido al interior del medio extracelular. Para una transferencia eficiente de los ácidos nucleicos, el escape endosómico parece entonces ser una de las etapas más importantes, además de la eficiencia de la transfección misma. Hasta ahora, existen enfoques diferentes que abordan estos aspectos. Sin embargo, ningún enfoque fue exitoso en todos aspectos.

Los agentes de transfección usados en la técnica actualmente comprenden típicamente péptidos, diferentes polímeros, lípidos, así como nano y micropartículas (véase, por ejemplo, Gao, X., K. S. Kim, y col., (2007) , Aaps J 9 (1) : E92-104) . Estos agentes de transfección se han empleado típicamente con exito sólo en reacciones in vitro. Cuando se transfectan los ácidos nucleicos in vivoa células de un animal vivo, tienen que cumplirse requerimientos adicionales. Como ejemplo, el complejo tiene que ser estable en soluciones salinas fisiológicas en relación a la aglomeración. Además, no interactúa con partes del sistema de complemento del anfitrión. Además, el complejo deberá proteger al ácido nucleico de la degradación extracelular temprana por nucleasas de ocurrencia ubicua. Además, para aplicaciones terapéuticas génicas es de gran importancia que el portador no sea reconocido por el sistema inmunológico adaptivo (inmunogenicidad) y no estimule una tormenta de citocinas no específicas (respuesta inmune aguda) (véase Gao, Kim y col., (2007, citado arriba) ; Martin, M. E. y K. G. Rice (2007) , Aaps J 9 (1) : E18-29; y Foerg y Merkle, (2008, citado arriba) ) .

Foerg y Merkle (2008, supra) , describen el potencial terapéutico de medicamentosbasadosen péptidos, proteínas y ácidos nucleicos. De acuerdo con su análisis, el potencial terapéutico completo de estos medicamentos con frecuencia está comprometido por su limitada capacidad para cruzar la membrana plasmática de células de mamíferos, dando como resultado un acceso celular deficiente y una eficacia terapéutica inadecuada. Actualmente este obstáculo representa un gran reto para el desarrollo biomédico y el éxito comercial de muchos biofarmacéuticos.

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En este contexto, Gao y col. (Gao y col., The AAPS Journal 2007; 9 (1) Artículo 9) ven el reto primario de la terapia génica en el desarrollo de un método que suministre un gen terapéutico a células seleccionadas donde pueda lograrse la expresión génica adecuada. Ssin embargo, el suministro génico y particularmente la transfección exitosa de ácidos nucleicos en células o tejidosno es simple y típicamente depende de muchos factores. Para un suministro exitoso, por ejemplo el suministro de ácidos nucleicos o genes a células o tejidos, deben superarse muchas barreras. De acuerdo con Gao y col. (2007) , un método de suministro génico ideal debe cumplir tres criterios principales: (1) debe proteger al transgén contra la degradación por nucleasas en las matrices intercelulares, (2) debe llevar al transgén a través de la membrana plasmática y (3) no debe tener efectos dañinos.

Estas metas pueden lograrse usando una combinación de diferentes compuestos o vectores. Notablemente, existen algunos compuestos o vectores que superan al menos algunas de estas barreras.

Muy comúnmente, la transfección, por ejemplo de ácidos nucleicos, se lleva a cabo usando vectores virales o no virales. Para un suministro exitoso, estos vectores virales o no virales deben ser capaces de superar las barreras mencionadas arriba. Las estrategias de la terapia génica más exitosas disponibles actualmente se basan en el uso de vectores virales, tales como adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus y virus del herpes. Los vectores virales son capaces de mediar la transferencia génica con alta eficiencia y la posibilidad de una expresión génica a largo plazo, satisfaciendo 2 de los 3 criterios. Sin embargo, la respuesta inmune aguda, la inmunogenicidad y la mutagénesis de inserción descubierta en pruebas clínicas de terapia génica han generado serias preocupaciones de seguridad sobre algunos vectores virales usados habitualmente.

Una solución a este problema puede encontrarse en el uso de vectores no virales. Aunque los vectores no virales no son tan eficientes como los virales, se han desarrollado numerosos vectores no virales para proporcionar una alternativa más segura en la terapia génica. Los métodos de suministro génico no viral han sido explorados usando enfoques físicos (suministro génico libre de portadores) y químicos (suministro génico a base de vectores sintéticos) . Los enfoques físicos, que normalmente incluyen la inyección con agujas, electroporación, pistola génica, ultrasonido y suministro hidrodinámico, emplean una fuerza física que atraviesa la membrana celular y facilita la transferencia génica intracelular. Los enfoques químicos usan típicamente compuestos sintéticos o naturales (lípidos catiónicos, polímeros catiónicos, sistemas híbridos lípidos-polímeros) como portadores para suministrarel transgén al interior de las células. Aunque se ha logrado un progreso significativo en la ciencia básica y en las aplicaciones de varios sistemas de suministro génico no virales, la mayoría de los enfoques no virales aún son mucho menos eficientes que los virales, especialmente para el suministro génico in vivo (véase, por ejemplo, Gao y col., The AAPS Journal 2007; 9 (1) Artículo 9) .

Durante la década pasada, n se anunciaron... [Seguir leyendo]

1. Molécula portadora polimérica de fórmula (I) :

L-P1-S-[S-P2-S]n-S-P3-L

donde,

P1 y P3 son idénticos o diferentes y representan una cadena polimérica hidrófila lineal o ramificada, teniendo cada P1 y P3 al menos una parte -SH capaz de formar un enlace disulfuro bajo condensación con un componente P2, seleccionándose la cadena polimérica hidrófila ramificada o lineal independientemente de entre polietilenglicol (PEG) , poli-N- (2-hidroxipropil) metacrilamida, poli2- (metacriloiloxi) etilfosforilcolinas, poli (hidroxialquil-L-asparagina) , poli (2- (metacriloiloxi) etil

fosforilcolina) , hidroxietilalmidón o poli (hidroxialquil-L-glutamina) , donde la cadena polimérica hidrófila tiene un peso molecular de 1 kDa a de 100 kDa, P2 es un péptido o proteína catiónico o policatiónico, y tiene una longitud de 3 a de 100 aminoácidos, oes un polímero catiónico o policatiónico con un peso molecular de 0, 5 kDa a 30 kDa, teniendo cada P2 al menos dos partes -SH capaces de formar un enlace disulfuro bajo condensación con componentes P2 adicionales o con componentes P1 y/o P3; -S-S-es un enlace disulfuro; L es un ligando opcional que puede o no estar presente, y que puede seleccionarse independientemente de RGD, transferrina, folato, un péptido señal o una secuencia señal, una señal

o secuencia de localización, una señal o secuencia de localización nuclear (NLS) , un anticuerpo, un

péptido de penetración celular, TAT, un ligando de un receptor, citoquinas, hormonas, factores de crecimiento, moléculas pequeñas, carbohidratos, manosa, galactosa, ligandos sintéticos, agonistas de molécula pequeña, inhibidores o antagonistas de receptores, oanálogos de peptidomimético RGD; y n es un entero, seleccionado de un intervalo de 1 a 50, de preferencia en un intervalo de 1, 2, 3, 4 ó

5 a 10, muy preferiblemente en un intervalo de 1, 2, 3 ó 4 a 9 y donde cualquiera de los componentes P2 pueden ser iguales o diferentes, y donde al menos un componente aminoácido adicional (AA) x está presente o ausente en la molécula portadora polimérica, siendo AA un aminoácido y x un entero seleccionado de un rango de 1 a 100 y donde, si el componente (AA) x está presente, el al menos un componente aminoácido adicional

(AA) xes un enlazador entre los componentes P1 o P3 y el componente L, o, si el componente L está ausente, el al menos un componente aminoácido adicional (AA) x es una parte de los componentes P1 o P3.

2. Molécula portadora polimérica según la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula portadora 35 polimérica está representada por una de las siguientes fórmulas:

3. Molécula portadora polimérica según la fórmula (Ia)

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donde P1 y P3 son idénticos o diferentes y representan una cadena polimérica hidrófila lineal o ramificada, teniendo cada P1 y P3 al menos una parte -SH capaz de formar un enlace disulfuro bajo condensación con un componente P2, seleccionándose la cadena polimérica hidrófila ramificada o lineal independientemente de entre polietilenglicol (PEG) , poli-N- (2-hidroxipropil) metacrilamida, poli2- (metacriloiloxi) etilfosforilcolinas, poli (hidroxialquil-L-asparagina) , poli (2- (metacriloiloxi) etilfosforilcolina) , hidroxietilalmidón o poli (hidroxialquil-L-glutamina) , donde la cadena polimérica hidrófila tiene un peso molecular de 1 kDa a de 100 kDa, P2 es un péptido o proteína catiónico o policatiónico, y tiene una longitud de 3 a de 100 aminoácidos,

o es un polímero catiónico o policatiónico con un peso molecular de 0, 5 kDa a 30 kDa, teniendo cada P2 al menos dos partes -SH capaces de formar un enlace disulfuro bajo condensación con componentes P2 adicionales o con componentes P1 y/o P3; -S-S-es un enlace disulfuro; L es un ligando opcional que puede o no estar presente, y que puede seleccionarse independientemente de RGD, transferrina, folato, un péptido señal o una secuencia señal, una señal

o secuencia de localización, una señal o secuencia de localización nuclear (NLS) , un anticuerpo, un péptido de penetración celular, TAT, un ligando de un receptor, citoquinas, hormonas, factores de crecimiento, moléculas pequeñas, carbohidratos, manosa, galactosa, ligandos sintéticos, agonistas de molécula pequeña, inhibidores o antagonistas de receptores, o análogos de peptidomimético RGD; AA es un componente aminoácido, x un entero seleccionado de un rango de 1 a 100 a + b = n, siendo n un entero seleccionado de un intervalo de 1 a 50, de preferencia en un intervalo de 1, 2, 3, 4 ó 5 a10;

a es un entero seleccionado independientemente del entero b de un rango de 1 a 50, de preferencia en un intervalo de 1, 2, 3, 4 ó 5 a 10 y b es un entero seleccionado independientemente del entero a de un rango de 1 a 50, de preferencia en un intervalo de 1, 2, 3, 4 ó 5 a 10,

ydonde cualquiera de los componentes P2 pueden ser iguales o diferentes entre si, y donde los componentes individuales [S-P2-S] y [S- (AA) x-S] están presentes en cualquier orden en la subfórmula {[S-P2-S]a[S- (AA) x-S]b}.

4. Molécula portadora polimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a3, caracterizada porque el

componente de aminoácido (AA) x comprende un componente aminoácido aromático, un componente aminoácido hidrófilo, un componente aminoácido lipófilo, un componente aminoácido básico débil, un péptido de señal, una señal o secuencia de localización, una señal o secuencia de localización nuclear, un péptido de penetración celular, una proteína o péptido terapéuticamente activo, un antígeno o un epítopo antigénico, un antígeno tumoral, un antígeno patógeno, un antígeno animal,

un antígeno viral, un antígeno protozoario, un antígeno bacteriano, un antígeno alérgico, un antígeno autoinmune, un alergeno, un anticuerpo, una proteína o péptido inmunoestimulador o un receptor de células T específico de antígeno.

5. Molécula portadora polimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a4, caracterizada porqueel

componente aminoácido (AA) xestá presente como un componente aminoácido repetitivo mixto 45