PROCEDIMIENTO PARA PURIFICAR ARN A ESCALA PREPARATIVA POR HPLC.

Procedimiento para purificar ARN a escala preparativa, caracterizado porque el ARN se purifica por medio de HPLC o métodos de cromatografía líquida a presión baja o normal utilizando una fase porosa inversa como fase estacionaria,

caracterizada porque la fase porosa inversa es un poliestireno poroso no alquilado, incluido un poliestirenodivinilbenceno poroso no alquilado

La presente invención se refiere a un procedimiento para purificar ARN a escala preparativa por medio de HPLC y a la utilización de una fase porosa inversa como fase estacionaria en este método.

La HPLC (abreviatura de “Cromatografía Líquida de Alta Resolución (Alta Presión)”) es un método bien establecido para separar mezclas de sustancias ampliamente utilizado en bioquímica, química analítica y química clínica.

En el caso más sencillo, un aparato de HPLC consiste en una bomba con un reservorio de eluyente que contiene la fase móvil, un sistema de aplicación de muestras, una columna de separación que contiene la fase estacionaria y un detector. Además, se puede proporcionar también un colector de fracciones, con el que se pueden recoger por separado fracciones individuales después de la separación, fracciones que, por tanto, estarán disponibles para otras aplicaciones.

El análisis de ARN por HPLC de fase inversa de par iónico es conocido de A. Azarani y K.H. Hecker (Nucleic Acids Research, vol. 29, nº 2 e7). Aquí, la fase estacionaria consiste en una matriz de poliestireno-divinilbenceno alquilado no porosa. La elución prosigue con un sistema tampón de dos eluyentes. El tampón A se compone de una disolución acuosa de acetato de trietilamonio 0,1M (TEAA), pH 7,0, y el tampón B se compone de una disolución acuosa de TEAA 0,1M, pH 7,0, en acetonitrilo al 25%. La elución se lleva a cabo por medio de los tres sistemas de gradientes siguientes: un 38-40% de B durante 1 minuto, a un 60% de B durante 15 minutos, a un 66% de B durante 6 minutos, a un 70% de B durante 0,5 minutos, a un 100% de B durante 0,5 minutos, manteniendo al 100% B durante 1 minuto, hasta un 38% durante 1 minuto, manteniendo al 38% B durante 2 minutos. Alternativamente, se utiliza el siguiente programa de gradientes: un 38-60% durante 30 minutos, hasta un 100% de B durante 2 minutos, hasta un 38% de B durante 3 minutos. El siguiente se utiliza como tercer programa de gradientes: un 38-40% de B durante 1 minuto, hasta un 60% de B durante 3 minutos, hasta un 100% de B durante 1 minuto, manteniendo al 100% B durante 6 minutos, hasta un 38% de B durante 1 minuto, manteniendo al 38% B durante 1 minuto.

Por tanto, este método de HPLC implicaba la utilización de programas de gradientes relativamente complicados y caros. Además, sólo se pueden separar y analizar con este método cantidades analíticas de ARN de hasta 1.000 ng (1 μg ó 0,001 mg) como máximo.

El objeto de la presente invención consiste aquí en mejorar un método de este tipo con el propósito de que ya no presente los inconvenientes de la técnica anterior.

Ello se consigue de acuerdo con la invención por un medio de un procedimiento para purificar ARN a escala preparativa que se distingue en que el ARN se purifica por HPLC utilizando una fase porosa inversa como fase estacionaria. Así, en el método según la invención, un factor significativo es que se utiliza una fase porosa inversa.

En el contexto de la presente invención, el término “por HPLC” incluye diversos procedimientos HPLC, así como métodos de cromatografía líquida a presión baja o normal, que se pueden utilizar para llevar a cabo el método de la invención. Éstos pueden incluir HPLC de fase inversa (RP-HPLC), cromatografía, cromatografía de exclusión de tamaño, filtración en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica o cromatografía de par iónico, de entre las cuales es preferente la HPLC de fase inversa. Sin entrar en detalles, la HPLC de fase inversa se compone de una fase estacionaria no polar y de una fase móvil moderadamente polar. Una fase estacionaria habitual es, por ejemplo, una sílice tratada por ejemplo con RMe2SiCl, donde R es un grupo alquilo de cadena lineal tal como C18H37 o C8H17. Por tanto, el tiempo de retención es más largo para las moléculas que son más no polares por naturaleza, permitiendo que las moléculas polares se eluyan más rápidamente. El tiempo de retención aumenta mediante la adición de un disolvente polar a la fase móvil y disminuye mediante la adición de un disolvente más hidrofóbico.

Sin embargo, las distintas técnicas mencionadas anteriormente funcionan según el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de fuerzas las repulsivas entre un disolvente relativamente polar, el analito relativamente no polar y la fase estacionaria no polar (principio de fase inversa). La fuerza motriz en la unión del analito (molécula de ARN) a la fase estacionaria es la disminución en la zona del segmento no polar de la molécula de analito expuesta al disolvente. Este efecto hidrofóbico está dominado por la disminución de energía libre a partir de la entropía asociada a la minimización de la interfase molécula ordenada-disolvente polar. El efecto hidrofóbico se reduce mediante la adición de un disolvente más apolar en la fase móvil. Esto cambia el coeficiente de partición, de tal forma que el analito pasa más tiempo bajando por la columna en la fase móvil, eluyendo finalmente en la columna.

Las características de la molécula específica de ARN como analito pueden desempeñar un papel importante en sus propiedades de retención. En general, un analito con grupos funcionales más apolares resulta en un tiempo de retención más largo, ya que incrementa la hidrofobicidad de la molécula. Moléculas muy grandes, sin embargo, pueden resultar en una interacción incompleta entre la gran superficie del analito y la cadena alquilo. El tiempo de retención aumenta con la zona superficial hidrofóbica, que es más o menos inversamente proporcional al tamaño del soluto. Los compuestos de cadena ramificada eluyen más rápidamente que sus isómeros correspondientes debido a que el área superficial global disminuye.

Aparte de la hidrofobicidad de la fase móvil, otros modificadores de la fase móvil -según la invención- pueden afectar a la retención del analito (molécula de ARN). Por ejemplo, se puede considerar que la adición de sales inorgánicas provoca un aumento lineal en la tensión superficial de las soluciones acuosas y, debido a que la entropía de la interfase analito-disolvente está controlada por la tensión superficial, la adición de sales tiende a incrementar el tiempo de retención. Otro componente importante que se puede utilizar de acuerdo con la invención es el pH, ya que puede cambiar la hidrofobicidad del analito. Por esta razón, se puede utilizar un agente tampón tal como fosfato de sodio u otros agentes tampones comunes para controlar el pH. Se puede añadir a la fase móvil un ácido orgánico tal como ácido fórmico o, más habitualmente, ácido trifluoroacético. Las modificaciones anteriores pueden ser útiles para múltiples propósitos: controlan el pH, neutralizan la carga sobre cualquier material residual expuesto en la fase estacionaria y actúan como agentes de apareamiento iónico para neutralizar la carga del analito. El efecto varía según el uso, pero generalmente se mejora la cromatografía.

Para los propósitos de la presente invención, se entiende que el término “purificación” significa que el ARN deseado en una muestra se separa y/o se aísla de las impurezas presentes en la misma. Así, después de la purificación por HPLC, el ARN está presente en una forma más pura que en la muestra que contenía el ARN originalmente introducido antes de la purificación por HPLC.

Los constituyentes no deseados de las muestras que contienen ARN y que, por tanto, deben ser separados pueden ser en particular fragmentos degradados o fragmentos que han surgido como resultado de la terminación prematura de la transcripción o también de transcripciones excesivamente largas si los plásmidos no están linearizados completamente. Además, se pueden separar impurezas tales como enzimas, por ejemplo las RNAsas y polimerasas, así como nucleótidos.

Utilizando el procedimiento de acuerdo con la invención, se purifica el ARN, teniendo éste una mayor pureza después de la purificación que el material de partida. A este respecto, es conveniente que el grado de pureza se encuentre lo más cercano posible al 100%. Así, se puede lograr un grado de pureza superior al 70%, en particular el 80%, en especial el 90% y preferentemente el 99% o superior.

El procedimiento según la invención resulta en la purificación preparativa de ARN. Esto difiere del método analítico por HPLC que se describe en la técnica mencionada anteriormente (Azarani & Hecker). En un método analítico por HPLC, se introduce y separa una cantidad claramente más...

1. Procedimiento para purificar ARN a escala preparativa, caracterizado porque el ARN se purifica por medio de HPLC o métodos de cromatografía líquida a presión baja o normal utilizando una fase porosa inversa como fase estacionaria, caracterizada porque la fase porosa inversa es un poliestireno poroso no alquilado, incluido un poliestirenodivinilbenceno poroso no alquilado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona el ARN de entre ARNt, ARNr, ARNm o ARN celular total, en particular también variantes de ARN, tal como por ejemplo aptámeros o ribozimas.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ARN tiene un tamaño de hasta aproximadamente

15.000 nucleótidos o pares de bases, incluido un tamaño de hasta 100 a

10.000 nucleótidos o pares de bases.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la fase porosa inversa tiene un tamaño de partícula de 8 μm a 50 μm, en particular de 8 a 30 μm, y especialmente de 8 a 25 μm y/o un tamaño de poro de 1.000 Å a 5.000 Å o un tamaño de poro de

1.000 Å a 4.000 Å.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la fase porosa inversa está compuesta de perlas o aparece como un bloque polimerizado.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la columna de HPLC tiene una longitud de más de 5 cm, en particular hasta 100 cm y un diámetro de más de 4 mm, en particular hasta 25 mm, preferentemente hasta 1 m, especialmente hasta 100 cm.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la purificación por HPLC se realiza según un método de par iónico, añadiéndose un ión con carga positiva a la fase móvil como contraión para el ARN cargado negativamente, o por cromatografía de exclusión de tamaños, filtración en gel, cromatografía de

afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica o cromatografía de par iónico.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se utiliza una mezcla de un disolvente acuoso y un disolvente orgánico para la purificación por HPLC con el propósito de la elución.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque el disolvente acuoso es un tampón, donde el tampón se selecciona preferentemente de entre acetato de trietilamonio, ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido fórmico, tampón acetato, tampón fosfato, bisulfato de tetrabutilamonio, bromuro de tetrabutilamonio y cloruro de tetrabutilamonio.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque el tampón de acetato de trietilamonio es un tampón de acetato de trietilamonio 0,1M.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque el disolvente orgánico es acetonitrilo, metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol y acetona o una mezcla de los mismos.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque la fase móvil es una mezcla de acetato de trietilamonio 0,1M y acetonitrilo.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque la fase móvil contiene del 5,0% en volumen al 25,0% en volumen de disolvente orgánico, en relación con la fase móvil, y para que alcance el 100% en volumen con el disolvente acuoso, o caracterizado porque la fase móvil contiene del 7,5% en volumen al 17,5% en volumen, en particular del 9,5 al 14,4% en volumen, de disolvente orgánico, con relación a la fase móvil, y para que alcance el 100% en volumen con el disolvente acuoso.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la separación se desarrolla de forma isocrática.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque se desarrolla una separación en gradientes. 16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque, en el caso de una separación en gradiente, la proporción de disolvente orgánico aumenta en particular en al menos un 10%, preferentemente en al menos un 50% y especialmente en al menos un 100%, opcionalmente 5 en al menos un 200%, con respecto al % en volumen inicial en la fase móvil. 17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque la proporción de disolvente orgánico en la fase móvil se eleva durante la separación por HPLC a desde el 3 hasta el 9%, preferentemente del 4 al 10 7,5%, en particular del 5,0% en volumen, o aumenta del 3 al 9, en particular del 5,0% en volumen al 20,0% en volumen, en cada caso con respecto a la fase móvil, o aumenta del 6,5 al 8,5, en particular del 7,5% en volumen al 17,5% en volumen, en cada caso con relación a la fase móvil. 15 18. Utilización de una fase porosa inversa en un método de HPLC según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizada porque la fase porosa inversa es un poliestireno poroso no alquilado, incluyendo un poliestirenodivinilbenceno poroso no alquilado.