Conjugados de polialquilenglicol de interferón beta-1a y sus usos.

Una composición que comprende un interferón-beta-1a o una proteína de fusión que comprende el interferónbeta-1a,

en la que el interferón-beta-1a consiste en la secuencia de aminoácidos:**Fórmula**

en la que el interferón-beta-5 1a está acoplado a un único polímero que no se da de forma natural en el extremo Nterminalde dicho interferón-beta-1a, en el que el acoplamiento entre el interferón-beta-1a y dicho polímero esobtenible mediante el uso de un método de alquilación reductora, y en el que dicho polímero comprende un resto depolialquilenglicol.

Conjugados de polialquilenglicol de interferón beta-1a y sus usos Antecedentes de la invención El uso de polipéptidos y proteínas para el tratamiento sistémico de enfermedades específicas está bien aceptado actualmente en la práctica médica. El papel que juegan estas sustancias en la terapia es tan importante que muchas actividades investigadoras se están dirigiendo hacia la síntesis de grandes cantidades mediante técnicas de ADN recombinante. Muchos de estos polipéptidos son moléculas endógenas que son muy potentes y específicas al desencadenar sus acciones biológicas.

Un factor importante que limita la utilidad de estas sustancias proteicas para su aplicación deseada es que, cuando se administran de forma parenteral, se eliminan del cuerpo en un corto periodo de tiempo. Esto puede ocurrir como resultado del metabolismo de proteasas o por el aclaramiento, que usa rutas normales para la eliminación de proteínas tales como la filtración en los riñones. La vía de administración oral de estas sustancias es incluso más problemática, porque, además de la proteolisis en el estómago, la elevada acidez del estómago las destruye antes de que alcancen su tejido de destino. Los problemas asociados con estas vías de administración de proteínas se conocen bien en la industria farmacéutica, y se están usando diversas estrategias en intentos para resolverlas.

Se han publicado muchos trabajos que se ocupan de la estabilización de proteínas. Se conocen diversas formas de conjugar proteínas con materiales poliméricos, que incluyen el uso de dextranos, polivinilpirrolidonas, glucopéptidos, polietilenglicol y poliaminoácidos. Se ha informado que los polipéptidos conjugados resultantes mantienen sus actividades biológicas y la solubilidad en agua para aplicaciones parenterales.

Una familia de péptidos que ha sido el centro de mucho trabajo clínico y esfuerzos para mejorar su administración y bioasimilación son los interferones. Los interferones se han ensayado en una diversidad de enfermedades clínicas. El uso de interferón beta humano, un miembro de esa familia, es el mejor establecido en el tratamiento de esclerosis múltiple. Recientemente se ha autorizado la comercialización de dos formas de interferón beta recombinante en Europa y EE.UU. para el tratamiento de esta enfermedad. Una forma es interferón-beta-1a (denominado comercialmente y vendido como AVONEX®, fabric. Biogen, Inc., Cambridge, MA) y en lo sucesivo "interferón-beta1a" o "IFN-beta-1a" o "IFN-β-1a" o "interferón-β-1a", usados de forma intercambiable. La otra forma es interferónbeta-1b (denominado comercialmente y vendido como BETASERON®, Berlex, Richmond, CA) , en lo sucesivo, "interferón-beta-1b". Interferón-beta-1a se produce en las células mamíferas usando la secuencia del gen humano natural y está glicosilado, mientras interferón-beta-1b se produce en bacterias E. coli usando una secuencia modificada del gen humano que contiene una sustitución de cisteína a serina introducida mediante ingeniería genética en la posición del aminoácido 17 y no está glicosilado.

Previamente, se han comparado directamente las potencias in vitro relativas de interferón-beta-1a e interferón beta 1b en análisis funcionales y se ha demostrado que la actividad específica de interferón-beta-1a es aproximadamente 10 veces mayor que la actividad específica de interferón-beta-1b (Runkel et al., 1998, Pharm. Res. 15: 641-649) . A partir de estudios diseñados para identificar la base estructural de estas diferencias de actividad, se ha identificado la glicosilación como la única de las diferencias estructurales conocidas entre los productos que afecta a la actividad específica. El efecto del hidrato de carbono se manifiesta en gran medida por medio de su papel estabilizante de la estructura. El efecto estabilizante del hidrato de carbono fue evidente en experimentos de desnaturalización térmica y análisis SEC. La falta de glicosilación también se correlacionó con un incremento en la agregación y una sensibilidad incrementada a la desnaturalización térmica. La eliminación enzimática del hidrato de carbono de interferón-beta-1a con PNGasa F provocó la precipitación considerable del producto desglicosilado.

Estos estudios indican que, a pesar de la conservación de secuencias entre interferón-beta-1a e interferón-beta-1b, son entidades bioquímicas distintas, y por lo tanto gran parte de lo que se sabe sobre interferón-beta-1b no se puede aplicar a interferón-beta-1a, y viceversa.

El documento WO 87/00056 describe conjugados entre un homopolímero de polietilenglicol o un poliol polioxietilado, y un interferón-beta (véase el resumen, página 13, líneas 15-35) . En este documento no se prevé la combinación específica de un interferón-beta 1a, su acoplamiento con el polímero anteriormente mencionado en el extremo Nterminal y por medio de una unión obtenible mediante una alquilación reductora.

Katre N. V. (Advanced Drud Deliver y Reviews, 10 (1993) , 91-114) describe el acoplamiento selectivo de restos de polialquilenglicol en el extremo N-terminal de proteínas diferentes de los interferones.

Sumario de la invención Se han aprovechado las ventajas del interferón-beta glicosilado respecto de las formas sin glicosilar. En particular, se ha desarrollado una composición de interferón-beta-1a con actividad incrementada respecto de interferón-beta1b, y que también tiene las propiedades convenientes de las proteínas pegiladas en general sin pérdida efectiva de actividad comparado con las formas de interferón-beta-1a que no están conjugadas. Así, si se hacen modificaciones de tal forma que los productos (conjugados de polímero-interferón-beta 1a) mantienen todas o casi todas sus actividades biológicas, pueden darse como resultado las siguientes propiedades: farmacocinética y farmacodinámica alteradas que llevan a una semivida incrementada y a alteraciones en la distribución tisular (p.ej., capacidad para permanecer en la vasculatura durante períodos de tiempo más largos) , estabilidad incrementada en disolución, inmunogenicidad reducida, protección de la digestión proteolítica y de la supresión posterior de la actividad. Tal formulación es un avance sustancial en las técnicas farmacéutica y médica, y haría una contribución significativa al tratamiento de diversas enfermedades en las que el interferón tiene cierta utilidad, tales como esclerosis múltiple, fibrosis, y otras enfermedades inflamatorias o autoinmunes, cánceres, hepatitis y otras enfermedades víricas. En particular, la capacidad para permanecer durante períodos de tiempo más largos en la vasculatura permite que se use interferón-beta-1a para inhibir la angiogénesis y potencialmente atravesar la barrera hematoencefálica. Además, la estabilidad térmica adquirida creando conjugados de polímero-interferón-beta-1a es una ventaja cuando se formula interferón-beta-1a en forma de polvo para uso en la administración posterior por medio de inhalación.

Se usó el conocimiento de la estructura cristalográfica de interferón-beta-1a y se desarrolló un conjugado de interferón-beta-1a-polímero en el que el polímero está unido a el/los sitio (s) de interferón-beta-1a que permitirá (n) que el conjugado mantenga la actividad completa del interferón-beta-1a comparado con el interferón-beta-1a que no está conjugado.

Un caso de la descripción es un complejo de interferón-beta-1a conjugado, en el que el interferón-beta-1a está unido de forma covalente a un polímero que incorpora como parte integral suya un polialquilenglicol.

En un caso particular, la presente descripción se refiere a una composición de interferón-beta-1a fisiológicamente activo que comprende interferón-beta-1a fisiológicamente activo acoplado a un polímero que comprende un resto de polialquilenglicol, en el que el interferón-beta-1a y el resto de polialquilenglicol están dispuestos de forma que el interferón-beta-1a fisiológicamente activo de la composición tiene una semivida aumentada respecto del interferónbeta-1a solo (es decir, en una forma sin conjugar desprovista del polímero acoplado a él) .

Otro caso de la descripción es una composición de interferón-beta-1a que comprende interferón-beta-1a fisiológicamente activo acoplado a un polímero que comprende un resto de polialquilenglicol en el que el interferónbeta-1a es una proteína de fusión, preferiblemente una fusión con inmunoglobulina. En tal complejo, la estrecha proximidad del extremo N-terminal (sitio de conjugación con el polímero) y el extremo C-terminal (sitio de fusión con el resto Ig) sugiere que la conjugación del polímero puede reducir la inmunogenicidad de la proteína de fusión.

En otro caso, la presente descripción se refiere... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende un interferón-beta-1a o una proteína de fusión que comprende el interferónbeta-1a, en la que el interferón-beta-1a consiste en la secuencia de aminoácidos:

en la que el interferón-beta-1a está acoplado a un único polímero que no se da de forma natural en el extremo Nterminal de dicho interferón-beta-1a, en el que el acoplamiento entre el interferón-beta-1a y dicho polímero es obtenible mediante el uso de un método de alquilación reductora, y en el que dicho polímero comprende un resto de polialquilenglicol.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión comprende una porción de una molécula 10 de inmunoglobulina.

3. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que el polímero tiene un peso molecular de alrededor de 5 a alrededor de 40 kilodaltons.

4. Una composición farmacéutica que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. El uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de una composición 15 farmacéutica.

6. El uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores y cánceres, afecciones autoinmunitarias, enfermedades virales o enfermedades angiogénicas.

7. El uso de la reivindicación 6, en el que dichos tumores y cánceres se seleccionan del grupo que consiste en 20 sarcoma osteogénico, linfoma, leucemia linfática aguda, carcinoma de mama, melanoma o carcinoma nasofaríngeo.

8. El uso de la reivindicación 6, en el que dichas afecciones autoinmunitarias se seleccionan del grupo que consiste en fibrosis, lupus y esclerosis múltiple.

9. El uso de la reivindicación 6, en el que dichas enfermedades virales se seleccionan del grupo que consiste en infección por ECM, gripe, infecciones virales de las vías respiratorias, rabia y hepatitis.

10. El uso de la reivindicación 6, en el que dichas enfermedades angiogénicas se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, retinopatía de la prematuridad, degeneración macular, rechazo de injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasias retrolenticulares, rubeosis y síndrome de Osler-Webber.

11. Una composición que comprende un mutante de interferón-beta-1a o una proteína de fusión que comprende el

mutante de interferón-beta-1a, en el que el mutante de interferón-beta-1a consiste en una secuencia de aminoácidos 30 seleccionada de:

en la que el mutante de interferón-beta-1a está acoplado a un único polímero que no se da de forma natural en el extremo N-terminal de dicho mutante de interferón-beta-1a, en el que el acoplamiento entre el mutante de interferónbeta-1a y dicho polímero es obtenible mediante el uso de un método de alquilación reductora, y en el que dicho polímero comprende un resto de polialquilenglicol.

12. La composición de la reivindicación 11, en la que la proteína de fusión comprende una porción de una molécula de inmunoglobulina.

13. Una composición farmacéutica que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12.

14. Un método in vitro para prolongar la actividad del interferón-beta-1a en un sistema in vitro, que comprende acoplar dicho interferón-beta-1a en el extremo N-terminal a un único resto de polímero que no se da de forma natural mediante el uso de un método de alquilación reductora para proporcionar una composición de polímero-interferónbeta-1a acoplado, e introducir la composición de polímero-interferón-beta-1a acoplado en el sistema in vitro, y dicho resto de polímero que no se da de forma natural comprende un resto de polialquilenglicol.

15. El uso de un resto de polímero que no se da de forma natural para proporcionar una composición de polímerointerferón-beta-1a acoplado como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de una composición farmacéutica, y dicho resto de polímero que no se da de forma natural comprende un resto de polialquilenglicol.

16. El uso de la composición de la reivindicación 3 para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la angiogénesis en un sujeto.

17. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, 11 y 12, en la que el polímero es polietilenglicol.

18. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, 11, 12 y 17, en la que el polímero tiene un peso molecular de entre 10.000 y 40.000 daltons.

19. La composición según la reivindicación 18, en la que el polímero tiene un peso molecular de 20.000 daltons.

20. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso en el tratamiento de tumores y cánceres, afecciones autoinmunitarias, enfermedades virales o enfermedades angiogénicas.

21. La composición para el uso según la reivindicación 20, en la que dichos tumores y cánceres se seleccionan del grupo que consiste sarcoma osteogénico, linfoma, leucemia linfática aguda, carcinoma de mama, melanoma o carcinoma nasofaríngeo.

22. La composición para el uso según la reivindicación 20, en la que dichas afecciones autoinmunitarias se seleccionan del grupo que consiste en fibrosis, lupus y esclerosis múltiple.

23. La composición para el uso según la reivindicación 20, en la que dichas enfermedades virales se seleccionan del grupo que consiste en infección por ECM, gripe, infecciones virales de las vías respiratorias, rabia y hepatitis.

24. La composición para el uso según la reivindicación 20, en la que dichas enfermedades angiogénicas se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, retinopatía de la prematuridad, degeneración macular, rechazo de injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasias retrolenticulares, rubeosis y síndrome de Osler-Webber.

25. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso en el tratamiento de la esclerosis múltiple.

26. El uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la esclerosis múltiple.

Actividad de antiproliferación (% de t. n.) Actividad antiviral (% de t. n.)

FIG. 6

Temperatura (ºC)

Temperatura (ºC)

FIG. 8

FIG. 9