Neublastina glucosilada conjugada con polímero.

Un dímero que comprende un primer polipéptido de neublastina y un segundo polipéptido de neublastina,

en el que: (a) al menos uno de los polipéptidos está glucosilado; (b) al menos uno de los polipéptidos está conjugado en su N-5 terminal con un polímero sintético soluble en agua; y (c) ninguno de los polipéptidos está conjugado con un polímero sintético soluble en agua en una posición distinta al N-terminal.

Neublastina glucosilada conjugada con polímero Campo de la invención La invención se refiere a química de proteínas, biología molecular, neurobiología, neurología y gestión del dolor.

Antecedentes de la invención Los factores neurotróficos son proteínas de origen natural que regulan la supervivencia neuronal durante el desarrollo, y regulan la plasticidad y la integridad estructural del sistema nervioso adulto. Estos factores neurotróficos pueden clasificarse en superfamilias, familias, subfamilias y especies individuales según su estructura y su función.

Las superfamilias de factores neurotróficos incluyen la superfamilia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) , la superfamilia de la neurotrofina y la superfamilia del factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) . Los ligandos relacionados con el factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) son una familia de proteínas dentro de la superfamilia del TGF-β. Los ligandos relacionados con el GDNF incluyen el GDNF, la persefina (PSP) , la neurturina (NTN) y la neublastina (NBN; conocida como atermina o enovina) . Los miembros de la familia de ligandos relacionados con el GDNF se distinguen, entre otras cosas, por sus siete residuos de cisteína conservados. Estos residuos forman puentes disulfuro intramoleculares e intermoleculares y dan lugar a la estructura terciaria y secundaria del ligando polipeptídico dimerizado. Los miembros de la familia también inducen la señalización a través de un complejo receptor multicomponente que consiste en un co-receptor anclado a glucosilfosfatidil inositol (GPI) de la familia GFRα, un miembro de la subfamilia de ligandos relacionados con el GDNF y el receptor de cinasa de tirosina RET.

El RET activado inicia una cascada de transducción de señales que es responsable, al menos en parte, de los efectos cascada abajo de los ligandos relacionados con el GDNF.

La neublastina se clasifica dentro de la familia del GDNF porque comparte regiones de homología con otros ligandos del GDNF, incluyendo el motivo de siete cisteínas (por ejemplo, como se describe en el documento EP02/02691, en las publicaciones PCT US02/02319 y US02/06388) , y debido que se une a, y activa, el receptor RET como parte de un complejo GFRα. La neublastina es muy selectiva para la unión al complejo receptor GFRα3-RET. A este respecto, la neublastina contiene subregiones únicas en su secuencia de aminoácidos en comparación con otros miembros de la familia de ligandos relacionados con el GDNF

La administración de neublastina es potencialmente útil en el tratamiento de enfermedades asociadas con una degeneración y una disfunción neuronal. Sin embargo, la neublastina se elimina rápidamente del cuerpo, lo que puede afectar al paradigma de dosificación de neublastina requerida en aplicaciones terapéuticas. Por tanto, existe la necesidad de moléculas que muestren la actividad biológica de la neublastina y al mismo tiempo tengan una potencia aumentada.

Sumario de la invención Se ha descubierto que cuando una proteína de neublastina, es decir, un dímero, es glucosilado internamente y conjugado en su amino terminal con un polímero sintético soluble en agua, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) , se mejora significativamente la biodisponibilidad y la semivida en suero. Por lo tanto, se consigue una eficacia in vivo con dosis menores.

Basándose en este descubrimiento, la invención presenta un dímero que contiene un primer polipéptido de neublastina y un segundo polipéptido de neublastina, en los que: (a) al menos uno de los polipéptidos está glucosilado; (b) al menos uno de los polipéptidos está conjugado en su N-terminal con un polímero sintético soluble en agua; y (c) ninguno de los polipéptidos está conjugado con un polímero sintético soluble en agua en una posición distinta al N-terminal.

El (los) polipéptido (s) de neublastina puede (n) ser, por ejemplo, NBN113 (ID. SEC. Nº : 2) , NBN140 (ID. SEC. Nº : 6) , NBN116 (ID. SEC. Nº : 7) , NBN112 (ID. SEC. Nº : 8) , NBN111 (ID. SEC. Nº : 9) , NBN110 (ID. SEC. Nº : 10) , NBN109 (ID. SEC. Nº : 11) , NBN108 (ID. SEC. Nº : 12) , NBN107 (ID. SEC. Nº : 13) , NBN106 (ID. SEC. Nº : 14) , NBN105 (ID. SEC. Nº : 15) , NBN104 (ID. SEC. Nº : 16) , NBN103 (ID. SEC. Nº : 17) , NBN102 (ID. SEC. Nº : 18) , NBN101 (ID. SEC. Nº : 19) , NBN100 (ID. SEC. Nº : 20) y NBN99 (ID. SEC. Nº : 21) . Un polipéptido preferido para su incorporación en el dímero es NBN104 (ID. SEC. Nº : 16) .

En algunas formas de realización, la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido de neublastina y del segundo polipéptido de neublastina es la misma. Preferiblemente, el polímero sintético soluble en agua es un polialquilenglicol, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) .

Preferiblemente, el peso molecular total medio de la fracción o las fracciones de polialquilenglicol conjugadas con el dímero es de 10 -50 kDa; más preferiblemente de 15 -45 kDa; y lo más preferiblemente de 20 -40 kDa. La fracción de polialquilenglicol puede ser lineal o ramificada.

La invención proporciona una composición que comprende el dímero de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona un método para el tratamiento del dolor neuropático en un mamífero, por ejemplo, en un ser humano. El método incluye la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de un dímero de la invención. La invención proporciona un método para el tratamiento de la alodinia táctil en un mamífero. El método incluye la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de un dímero de la invención. La invención proporciona un método para tratar la hiperalgesia térmica en un mamífero. El método incluye la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de un dímero de la invención. La invención proporciona un de método para la activación del receptor RET en un mamífero. El método incluye la administración al mamífero de una cantidad eficaz de un dímero de la invención.

En algunas formas de realización de la invención, la cantidad terapéuticamente eficaz es desde 0, 1 ï?­g/kg hasta 1.000 ï?­g/kg. En algunas formas de realización, la cantidad terapéuticamente eficaz es desde 1 ï?­g/kg hasta 100 ï?­g/kg. En algunas formas de realización, la cantidad terapéuticamente eficaz es desde 1 ï?­g/kg hasta 30 ï?­g/kg. En algunas formas de realización, la cantidad terapéuticamente eficaz es desde 3 ï?­g/kg hasta 10 ï?­g/kg. Preferiblemente, la vía de administración es intramuscular o subcutánea.

Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado al comprendido habitualmente por el experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica de la invención pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento, a continuación se describen los métodos y materiales adecuados.

Salvo que se indique de otro modo, cualquier referencia a un número de residuo de aminoácido del polipéptido de neublastina se corresponde con la numeración de la ID. SEC. Nº : 1.

Según se usa en este documento, "neublastina consenso" significa la secuencia de la ID. SEC. Nº : 1

Según se usa en este documento, "polipéptido de neublastina" significa un polipéptido que (1) muestra al menos una actividad biológica de neublastina cuando está dimerizado como un homodímero, y (2) incluye una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90 % a los aminoácidos 8 -113 de la ID. SEC. Nº : 2.

Según se usa en este documento, "polipéptido de neublastina de origen natural" significa un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia del polipéptido de neublastina de origen natural. Algunos ejemplos de neublastinas de origen natural son la neublastina humana (ID. SEC. Nº : 2) , la neublastina de ratón (ID. SEC. Nº : 3) , y la neublastina de rata (ID. SEC. Nº : 4) .

El porcentaje de identidad entre las secuencias de aminoácidos puede ser determinado mediante el uso del programa BLAST 2.0 (disponible en www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) o una versión posterior del mismo. La comparación entre secuencias puede realizarse mediante el uso de un alineamiento ungapped y mediante el uso de los parámetros por defecto (matriz Blossom 62, penalización por existencia de gap de 11, penalización por gap residual de 1, y una proporción lambda de 0, 85) . El algoritmo matemático usado en los programas BLAST se describe en Altschul y col., 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389 -3402.

Otras características y ventajas de la invención serán... [Seguir leyendo]

1. Un dímero que comprende un primer polipéptido de neublastina y un segundo polipéptido de neublastina, en el que: (a) al menos uno de los polipéptidos está glucosilado; (b) al menos uno de los polipéptidos está conjugado en su N-terminal con un polímero sintético soluble en agua; y (c) ninguno de los polipéptidos está conjugado con un polímero sintético soluble en agua en una posición distinta al N-terminal.

2. El dímero de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el primer polipéptido de neublastina se elige de entre el grupo que consiste en NBN140 (ID. SEC. Nº : 6) , NBN116 (ID. SEC. Nº : 7) , NBN112 (ID. SEC. Nº : 8) , NBN111 (ID. SEC. Nº : 9) , NBN110 (ID. SEC. Nº : 10) , NBN109 (ID. SEC. Nº : 11) , NBN108 (ID. SEC. Nº : 12) , NBN107 (ID. SEC. Nº : 13) , NBN106 (ID. SEC. Nº : 14) , NBN105 (ID. SEC. Nº : 15) , NBN103 (ID. SEC. Nº : 17) , NBN102 (ID. SEC. Nº : 18) , NBN101 (ID. SEC. Nº : 19) , NBN100 (ID. SEC. Nº : 20) y NBN99 (ID. SEC. Nº : 21) .

3. El dímero de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido de neublastina es NBN113 (ID. SEC. Nº : 2) .

4. El dímero de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido de neublastina es NBN104 (ID. SEC. Nº : 16) . 20

5. El dímero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido de neublastina y del segundo polipéptido de neublastina son la misma.

6. El dímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polímero sintético soluble en agua es una 25 fracción de polialquilenglicol.

7. El dímero de la reivindicación 6, en el que el aminoácido N-terminal del primer polipéptido de neublastina y el aminoácido N-terminal del segundo polipéptido de neublastina están conjugados cada uno con una fracción de polialquilenglicol.

8. El dímero de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en el que la fracción de polialquilenglicol es lineal.

9. El dímero de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en el que la fracción de polialquilenglicol está ramificada.

10. El dímero de la reivindicación 6 ó 7, en el que la fracción de polialquilenglicol es una fracción de polietilenglicol.

11. El dímero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que al menos uno de los polipéptidos está glucosilado en el resido de asparragina correspondiente a la asparragina de la posición 95 de la ID. SEC. Nº : 2.

12. Una composición que comprende el dímero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un portador farmacéuticamente aceptable.

13. El dímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 para su uso como un medicamento. 45

14. El dímero para su uso como en la reivindicación 13, en el que el medicamento es para su uso en un ser humano.

15. Uso del dímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 en la preparación de un medicamento para el

tratamiento del dolor neuropático, de la alodinia táctil o de la hiperalgesia térmica en un ser humano. 50

16. El uso de la reivindicación 15, en el que al ser humano se le coadministra una cantidad eficaz del dímero y de un agente analgésico.

17. El uso de de la reivindicación 15, en el que la vía de administración al ser humano es intravenosa, intramuscular 55 o subcutánea.

18. El dímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 para su uso en el tratamiento del dolor neuropático en un ser humano.

19. El dímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 para su uso en el tratamiento de una neuropatía periférica en un ser humano.

20. El dímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 para su uso en el tratamiento de una neuropatía diabética dolorosa en un ser humano. 65

21. El dímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 para su uso en el tratamiento de la alodinia táctil o de la hiperalgesia térmica en un ser humano.

22. El dímero para el uso de una cualquiera de las reivindicacione.

18. 21, en el que al ser humano se le coadministra una cantidad eficaz del dímero y de un agente analgésico.

23. El dímero para el uso de una cualquiera de las reivindicacione.

18. 21, en el que la vía de administración al ser humano es intravenosa, intramuscular o subcutánea.