Ensayos de agregación plaquetaria.

Un método in vitro para analizar la agregación plaquetaria, que comprende:

poner en contacto plaquetas con un agente activador de plaquetas seleccionado del grupo que consiste en ADP,colágeno, trombina, tromboxano, elastasa de neutrófilos, selectina P y convulxina;

poner en contacto las plaquetas activadas con un anticuerpo anti-CD40L; y

poner en contacto las plaquetas activadas con un agente de reticulación seleccionado del grupo que consiste ensCD40L, anticuerpo anti-IgG humana, anticuerpo anti-hFc, factor reumatoide (RF), célula accesoria positiva al receptorde Fc, proteína A soluble y receptor de Fc humano soluble,

en donde el anticuerpo anti-CD40L y el agente de reticulación no son un complejo inmunitario preformado y en don10de las plaquetas sedimentadas son indicativas de la agregación de las plaquetas..

Ensayos de agregación plaquetaria Campo de la invención La presente invención se refiere, en parte, a métodos para determinar la agregación plaquetaria, a métodos para determinar la propensión a la coagulación por administración de un anticuerpo anti-CD40L y a kits relacionados con dicho anticuerpo.

Antecedentes de la invención Se han observado complicaciones tromboembólicas (abreviadamente en lo sucesivo TEC, por la expresión inglesa Tromboembolic Complications) en algunas pruebas clínicas del anticuerpo anti-CD40L (CD40L es la abreviatura del ligando de CD40, también conocido como CD154) , en particular, el anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra CD40L. Sabiendo que es expresado por los linfocitos T activados, se demostró también que el CD40L, estaba presente en la superficie de las plaquetas humanas activadas y puede desempeñar un papel en la activación celular endotelial in vitro (Henn et al., Nature, 1998, 391, 591-594) . Sin embargo, está todavía sin definir el papel de la vía CD40/CD40L en la regulación de la coagulación in vivo al nivel de la interacción plaquetas/células endoteliales.

El CD40L es una proteína de membrana de tipo II para la que se describió primeramente que se expresaba en linfocitos T activados. La interacción de CD40L con su receptor, CD40, es crítica para la diferenciación y proliferación de los linfocitos B y el cambio de isotipo de inmunoglobulinas (Ig) inducido por linfocitos T auxiliares (Foy et al., Annu. Rev. Immunol., 1996, 14, 591-617; y van Kooten et al., J. Luekoc. Biol., 2000, 67, 2-17) . La implicación de la vía CD40/CD40L en la interacción de plaquetas con células endoteliales ha sido descrita recientemente (Henn et al., Nature, 1998, 391, 591-594) . En condiciones normales, el CD40L es almacenado en las plaquetas. Por activación, el CD40L se transloca a la superficie de las plaquetas acompañado por la aparición en la superficie de CD63, selectina P y otras diversas proteínas, así como la liberación de mediadores solubles desde los gránulos intra-plaquetarios (Murano G. Basic Concepts of Hemostasis and Thrombosis, 1980, Boca Raton, FL, CRC Press, Inc.) . Por tanto, el CD40L puede desempeñar un papel en la actividad procoagulante.

Se han encontrado niveles elevados de CD40L soluble (sCD40L) en la sangre de pacientes que padecen lupus (Kato et al., J.Clin. Invest., 1999, 104, 947-955; y Vakkalanka et al., Arthritis Rheum., 1999, 42, 871-881) . El factor reumatoide (abreviadamente en lo sucesivo RF, por la expresión inglesa Rheumoid Factor) , un auto-anticuerpo para la porción Fc de Ig, se detecta frecuentemente en los sueros de pacientes con trastornos autoinmunitarios (Mageed et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1997, 815, 296-311) . Adicionalmente, la administración del anticuerpo anti-CD40L podría dar como resultado la producción de anticuerpos dirigidos contra el anticuerpo anti-CD40L.

Sumario de la invención La presente invención proporciona métodos in vitro para ensayar la agregación plaquetaria, que comprenden poner en contacto las plaquetas con un agente activador de plaquetas, poner en contacto las plaquetas activadas con un anticuerpo anti-CD40L y poner en contacto las plaquetas activadas con un agente de reticulación, en donde la agregación se cuantifica por sedimentación de las plaquetas. El anticuerpo anti-CD40L y el agente de reticulación no son un complejo inmunitario preformado. El agente activador de las plaquetas se selecciona de adenosina-difosfato (ADP) , colágeno, trombina, tromboxano, elastasa de neutrófilos, selectina P y convulxina. Las plaquetas se pueden obtener de plasma rico en plaquetas (PRP) . En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40L es hu5c8. El agente de reticulación se selecciona de CD40L soluble (sCD40L) , anticuerpo anti-IgG humana, anticuerpo anti-HFc, RF, célula accesoria positiva al receptor de Fc, proteína A soluble y receptor de Fc humano soluble, La relación entre anticuerpo anti-CD40L y sCD40L, puede ser de 1:1000 a 1000:1, de 1:500 a 500:1 o 3:2.

La presente invención también proporciona métodos in vitro para determinar si un ser humano es propenso a la coagulación por administración de un anticuerpo anti-CD40L, que comprenden poner en contacto plaquetas retiradas de un ser humano con un agente activador de plaquetas, poner en contacto las plaquetas activadas con el anticuerpo anti-CD40L, poner en contacto las plaquetas activadas con un agente de reticulación y determinar la presencia o ausencia de agregación plaquetaria, en donde una agregación plaquetaria de 70% o mayor es indicativa de propensión a la coagulación. El anticuerpo anti-CD40L y el agente de reticulación no son un complejo inmunitario preformado. El agente activador de plaquetas se selecciona de ADP, colágeno, trombina, tromboxano, elastasa de neutrófilos, selectina P y convulxina. Las plaquetas se pueden obtener de plasma rica en plaquetas (PRP) . En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40L es hu5c8. El agente de reticulación se selecciona de sCD40L, anticuerpo anti-IgG humana, anticuerpo anti-HFc, RF, célula accesoria positiva al receptor de Fc, proteína A soluble y receptor Fc humano soluble, La relación entre anticuerpo anti-CD40L y sCD40L, puede ser de 1:1000 a 1000:1, de 1:500 a 500:1 o 3:2.

La presente invención también proporciona kits que comprenden un agente activador de plaquetas, un agente de reticulación, y un anticuerpo anti-CD40L. El agente activador de plaquetas se selecciona de ADP, colágeno, trombina, tromboxano, elastasa de neutrófilos, selectina P y convulxina. El anticuerpo anti-CD40L puede ser hu5c8. El agente de reticulación se selecciona de sCD40L, anticuerpo anti-IgG humana, anticuerpo anti-HFc, RF, célula acce2 5

soria positiva al receptor de Fc, proteína A soluble y receptor de Fc humano soluble, El kit puede comprender además al menos uno de una aguja, un recipiente para alojar sangre, un recipiente para alojar componentes de ensayo e instrucciones. En algunas realizaciones, el recipiente para alojar los componentes de ensayo es una cubeta.

La presente invención y sus realizaciones se exponen en las reivindicaciones anexas.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra los trazados producidos por el aparato perfilador de agregación plaquetaria BioData de 4 canales que representan los porcentajes de luz transmitida a través de las muestras en comparación con el control de PRP. Los trazados se terminan cuatro minutos después de la adición de cantidades sub-óptimas de ADP, y el valor final se considera que es el porcentaje de plaquetas agregadas. Se lleva a cabo una titulación con ADP para determinar la concentración sub-óptima de ADP para cada muestra de PRP.

La Figura 2 muestra que las plaquetas activadas expresan CD40L en la superficie. Se incubaron plaquetas humanas con o sin ADP 10 μM durante 1, 10, 20, 40 o 60 minutos. Como el CD40L en la superficie de las plaquetas es capaz de interaccionar con el anticuerpo anti-CD40L biotinilado, se cuantificó por transferencia Western el aumento de la activación inducida del CD40L en la superficie de las plaquetas para el anticuerpo anti-CD40L biotinilado asociado con las plaquetas activadas.

La Figura 3 muestra que la agregación plaquetaria es afectada por los complejos de anticuerpo anti-CD40L y sCD40L. El PRP se obtuvo de diez donantes sanos. El anticuerpo anti-CD40L y sCD40L se mezclaron al menos 20 minutos antes de la adición al PRP. Se realizó una titulación para cada donante para determinar una concentración de ADP que producía la agregación sub-óptima. La agregación se indujo usando la concentración sub-óptima de ADP. Cada punto indica el resultado de una persona.

La Figura 4 muestra que la agregación plaquetaria es potenciada específicamente por complejos del anticuerpo anti-CD40L y sCD40L recombinante. El PRP se obtuvo de un individuo sano. La agregación se indujo con ADP 0, 75 μM, que se determinó que era la sub-óptima para este donante. El anticuerpos anti-CD40L, hIgG, y anticuerpo el anti-CD40L aglicosilado se evaluaron a 200 μg/mL y sCD40L a 30 μg/mL. El anticuerpo anti-CD40L o hIgG se mezclaron con sCD40L recombinante durante no menos de 20 minutos antes de la adición a la cubeta que contenía PRP. Las barras representan los valores medios y las desviaciones típicas de dos puntos de datos.

Descripción de las realizaciones La presente invención proporciona métodos in vitro de ensayo de agregación plaquetaria, métodos para determinar si un ser humano es propenso a la coagulación por administración de un resto de unión a CD40L y a kits que se pueden utilizar en estos métodos.

En algunas realizaciones, las plaquetas se obtienen de un mamífero, tal como un ser humano. Las plaquetas pueden estar presentes en el PRP... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para analizar la agregación plaquetaria, que comprende:

poner en contacto plaquetas con un agente activador de plaquetas seleccionado del grupo que consiste en ADP, colágeno, trombina, tromboxano, elastasa de neutrófilos, selectina P y convulxina;

poner en contacto las plaquetas activadas con un anticuerpo anti-CD40L; y

poner en contacto las plaquetas activadas con un agente de reticulación seleccionado del grupo que consiste en sCD40L, anticuerpo anti-IgG humana, anticuerpo anti-hFc, factor reumatoide (RF) , célula accesoria positiva al receptor de Fc, proteína A soluble y receptor de Fc humano soluble,

en donde el anticuerpo anti-CD40L y el agente de reticulación no son un complejo inmunitario preformado y en donde las plaquetas sedimentadas son indicativas de la agregación de las plaquetas.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el agente activador de plaquetas es ADP.

3. El método de la reivindicación 1, en donde las plaquetas se obtienen de plasma rico en plaquetas.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-CD40L es hu5c8.

5. El método de la reivindicación 1, en donde el agente de reticulación se selecciona de sCD40L, anticuerpo anti-IgG humana y anticuerpo anti-hFc.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la relación entre el anticuerpo anti-CD40L y el agente de reticulación es de 1:1000 a 1000:1.

7. El método de la reivindicación 1, en donde la relación entre el anticuerpo anti-CD40L y el agente de reticulación es de 1:500 a 500:1.

8. El método de la reivindicación 1, en donde la relación entre el anticuerpo anti-CD40L y el agente de reticulación es

3:2.

9. El método de la reivindicación 1, en donde: el agente activador de plaquetas es ADP; y el agente de reticulación es sCD40L o anticuerpo anti-hFc.

10. Un método in vitro para determinar si un ser humano es propenso a la coagulación por administración de un anticuerpo anti-CD40L, que comprende:

poner en contacto plaquetas extraídas del ser humano con un agente activador de plaquetas seleccionado del grupo que consiste en ADP, colágeno, trombina, tromboxano, elastasa de neutrófilos, selectina P y convulxina;

poner en contacto las plaquetas activadas con el anticuerpo anti-CD40L; y

poner en contacto las plaquetas activadas con un agente de reticulación seleccionado del grupo que consiste en sCD40L, anticuerpo anti-IgG humana, anticuerpo anti-hFc, factor reumatoide (RF) , célula accesoria positiva al receptor de Fc, proteína A soluble y receptor de Fc humano soluble, en donde el anticuerpo anti-CD40L y el agente de reticulación no son un complejo inmunitario preformado; y

determinar la presencia o ausencia de agregación plaquetaria, en donde una agregación plaquetaria de 70% o mayor es indicativa de la propensión a la coagulación.

11. El método de la reivindicación 10, en donde el agente activador de plaquetas es ADP.

12. El método de la reivindicación 10, en donde las plaquetas se obtienen de plasma rico en plaquetas.

13. El método de la reivindicación 10, en donde el anticuerpo anti-CD40L es hu5c8.

14. El método de la reivindicación 10, en donde el agente de reticulación se selecciona de sCD40L, anticuerpo anti-IgG humana y anticuerpo anti-hFc.

15. El método de la reivindicación 10, en donde la relación entre el anticuerpo anti-CD40L y el agente de reticulación es de 1:1000 a 1000:1.

16. El método de la reivindicación 10, en donde la relación entre el anticuerpo anti-CD40L y el agente de reticulación es de 1:500 a 500:1.

17. El método de la reivindicación 10, en donde la relación entre el anticuerpo anti-CD40L y el agente de reticulación es 3:2.

18. El método de la reivindicación 10, en donde:

el agente activador de plaquetas es ADP; y 5 el agente de reticulación es sCD40L o anticuerpo anti-hFc.

19. Un kit que comprende un agente activador de plaquetas seleccionado del grupo que consiste en ADP, colágeno, trombina, tromboxano, elastasa de neutrófilos, selectina P y convulxina; un anticuerpo anti-CD40L; y un agente de reticulación seleccionado del grupo que consiste en sCD40L, anticuerpo anti-IgG humana, anticuerpo anti-hFc, factor reumatoide (RF) , célula accesoria positiva al receptor de Fc, proteína A soluble y receptor de Fc humano soluble.

20. El kit de la reivindicación 19, en donde el agente activador de plaquetas es ADP.

21. El kit de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo anti-CD40L es hu5c8.

22. El kit de la reivindicación 19, en donde el agente de reticulación se selecciona de sCD40L, anticuerpo anti-IgG humana y anticuerpo anti-hFc.

23. El kit de la reivindicación 19, que comprende además al menos una aguja, un recipiente para alojar sangre, un 15 recipiente para alojar los componentes del ensayo e instrucciones.

24. El kit de la reivindicación 23, en donde el recipiente para alojar los componentes de ensayo es una cubeta.