Anticuerpos monoclonales contra CD30 que carecen de restos fucosilo y xilosilo.

Un anticuerpo anti-CD30 glucosilado aislado, donde al menos el 90% es una única glucoforma, que carece derestos fucosilo y xilosilo.

Anticuerpos monoclonales contra CD30 que carecen de restos fucosilo y xilosilo

Antecedente de la invención La molécula de superficie celular CD30 es un miembro de la superficie del receptor del factor de necrosis tumoral (TNF-R) . Esta familia de moléculas tiene homología variable entre sus miembros e incluye el receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR) , CD120 (a) , CD120 (b) , CD27, CD40 y CD95. Estas moléculas se caracterizan típicamente por la presencia de múltiples repeticiones ricas en cisteína en la región extracitoplasmática (de Bruin, P.C., et al. Leukemia 9:1620-1627 (1995) ) . Los miembros de esta familia se consideran cruciales para regular la proliferación y diferenciación de linfocitos.

CD30 es una glucoproteína transmembrana tipo I con seis (seres humanos) o tres (murino y de rata) repeticiones ricas en cisteína con una secuencia bisagra central. CD30 existe como una molécula de membrana de 120 kDa que se desarrolla a partir de una proteína precursora intercelular de 90 kDa. Se desprende de la superficie celular como una proteína soluble (sCD30) de aproximadamente 90 kDa. El desprendimiento de sCD30 sucede como un proceso activo de células CD30 viables y no está simplemente causado por la liberación de células que se están muriendo o muertas. Los ADNc que codifican la proteína CD30 se han clonado a partir de bibliotecas de expresión de la línea de células T humanas HLTV-1 HUT-102 por inmunoexploración con anticuerpos monoclonales Ki-1 y Ber-H2 (Schwab, U., et al. Nature 299:65 (1982) ) . El ADNc de CD30 de ratón y rata se ha descubierto que codifica 498 y 493 aminoácidos, respectivamente. El ADNc de CD30 humana codifica 90 aminoácidos adicionales, parcialmente duplicados desde uno de los dominios ricos en cisteína. El gen de CD30 se ha mapeado en 1p36 en seres humanos y 5q36.2 en ratas.

CD30 se expresa preferentemente por células linfoides activadas. Específicamente, la estimulación de CD30 en células linfoides ha demostrado inducir efectos biológicos pleiotrópicos, incluyendo proliferación, activación, diferenciación y muerte celular, dependiendo del tipo celular, fase de diferenciación y presencia de otros estímulos (Gruss, H.J. et al., Blood 83:2045-2056 (1994) ) . CD30 se identificó originalmente por el anticuerpo monoclonal Ki-1, que es reactivo con antígenos expresados en células de Hodgkin y Reed-Sternberg de enfermedad de Hodgkin (Schwab et al., Nature 299:65 (1982) ) . Por consiguiente, CD30 se usa ampliamente como marcador clínico para linfoma de Hodgkin y malignidades hematológicas relacionadas (Froese et al., J. Immunol. 139:2081 (1987) ; Carde et al., Eur. J. Cancer 26:474 (1990) ) .

CD30 demostró posteriormente que se expresaba en un subconjunto de linfomas no Hodgkin (NHL) , incluyendo el linfoma de Burkitt, linfomas de células grandes anaplásicas (ALCL) , linfoma cutáneo de células T, linfomas de células escindidas pequeñas celulares, linfomas linfociticos, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticos, leucemia/linfomas de células T (ATLL) , leucemia de células T en adulto (T-ALL) , y linfomas foliculares entroblásticos/centrocíticos (cd/cc) (Stein et al., Blood 66:848 (1985) ; Miettinen, Arch. Pathol. Lab. Med. 116:1197 (1992) ; Piris et al., Histopathology 17:211 (1990) ; Burns et al., Am. J. Clin. Pathol. 93:327 (1990) ; y Eckert et al., Am. J. Dermatopathol. 11:345 (1989) ) , así como varias líneas transformadas de forma vírica tales como células T transformadas con virus linfotrópico de células T humanas I o II, y células B transformadas con el virus de Epstein-Barr (Stein et al., Blood 66:848 (1985) ; Andreesen et al., Blood 63:1299 (1984) ) . Además, se ha documentado la expresión de CD30 en carcinomas embrionarios, carcinomas no embrionarios, melanomas malignos, tumores mesenquimáticos, y líneas celulares mieloides y macrófagos en fases tardías de diferenciación (Schwarting et al., Blood 74:1678 (1989) ; Pallesen et al., Am J. Pathol. 133:446 (1988) ; Mechtersheimer et al., Cancer 66:1732 (1990) ; Andreesen et al., Am. J. Pathol. 134:187 (1989) ) .

Como el porcentaje de células CD30 positivas en individuos normales es bastante pequeño, la expresión de CD30 en células tumorales la convierte en una diana importante para terapia mediada por anticuerpos para dirigir específicamente agentes terapéuticos contra células neoplásicas CD30 positivas (Chaiarle, R., et al. Clin. Immunol. 90 (2) :157-164 (1999) ) . Se ha demostrado que la terapia mediada por anticuerpos aumenta la citotoxicidad de células CD30 positivas tanto por la activación del complemento como por la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCE) (Pohl C, et al. Int J Cancer 54:418 (1993) ) . Sin embargo, aunque los resultados obtenidos hasta la fecha establecen claramente a CD30 como una diana útil para inmunoterapia, también muestran que anticuerpos murinos actualmente disponibles no constituyen agentes terapéuticos ideales. La terapia pasiva con anticuerpos no ha sido eficaz in vitro o in vivo contra pacientes con enfermedad de Hodgkin refractaria. Un ensayo clínico del anticuerpo anti-CD30 Ber-H2 mostró la localización del anticuerpo, pero sin respuestas (Falini B. et al. (1992) Brit J Haematol. 82:38-45; Koon, H.B. et al. (2000) Curr Opin in Oncol. 12:588-593) . A través del acoplamiento de un anticuerpo anti-CD30 a una toxina de ricina desglucosilada-toxina de cadena A, se mostró citotoxicidad en el tratamiento de enfermedad de Hodgkin en un modelo de ratón SCID, aunque también se observaron toxicidades de grado 3 en los sujetos (Schell, R. et al. (2002) Annals of Oncology 13:57-66) . El documento WO03/059282 describe la caracterización de los anticuerpos monoclonales anti-CD30 humanos 5F11, 17G1 y 2H9. Borchmann et al (Blood; 2003; 102 (10) p3737-3742) también describe la caracterización del anticuerpo 5F11. Shinkawa et al (Journal of Biological Chemistr y ; 2003; 278 (5) p3466-3473) y Yamane-Ohnuki et al (Biotechnology and Bioengineering; 2004; 87 (5) p614-622) describen métodos para producir anticuerpos que carecen de fucosa que tienen ADCC potenciada.

Se han abordado varias especies de plantas para su uso en "cría molecular" de proteínas de mamífero de interés farmacéutico. Estos sistemas de expresión vegetales proporcionan una producción de bajo coste de proteínas de mamífero biológicamente activas y son fácilmente susceptibles a un aumento en escala rápido y económico (Ma et al. (2003) Nat. Rev. Genet. 4:794-805; Raskin et al. (2002) Trends Biotechnol. 20:522-531) . Gasdaska et al (Bioprocessing; 2003; 2 p49-56) y el documento US 2004/261148 describen la producción de proteínas terapéuticas incluyendo anticuerpos, usando la planta acuática Lemna (lenteja acuática) . Las diferencias en los patrones de glucosilación entre plantas y mamíferos ofrecen un reto a la factibilidad de sistemas de expresión vegetales para producir proteínas de mamífero recombinantes de alta calidad para uso farmacéutico. Se necesitan métodos para alterar el patrón de glucosilación en proteínas expresadas en plantas, específicamente para inhibir la glucosilación específica de plantas de la estructura núcleo eucariota, para producir de forma ventajosa proteínas de mamífero recombinantes con un patrón de glucosilación humanizado.

Por consiguiente, existe la necesidad de anticuerpos terapéuticos mejorados contra CD30 que sean más eficaces para tratar y/o prevenir enfermedades mediadas por CD30.

Sumario de la invención La presente invención proporciona un anticuerpo anti-CD30 glucosilado aislado, donde al menos un 90% es una glucoforma individual, que carece de los restos fucosilo y xilosilo, y que, opcionalmente, no contiene restos galactosilo.

En otro aspecto, la invención se refiere a:

- una composición de glucoproteína que comprende una composición de anticuerpo anti-CD30 que comprende un perfil de N-glucosilación donde al menos el 90% de las especies de N-glucanos presentes en dicho perfil son GlcNAc2Man3GlcNAc2 (G0) , comprendiendo dicho perfil una cantidad traza de especies precursoras de Nglucano, donde dicha especie precursora de N-glucano se selecciona entre Man3GlcNAc2, GlcNaclMan3GlcNAc2 donde GlcNac está unido al brazo de 1, 3 manosa (MGn) , GlcNaclMan3GlcNAc2 donde GlcNac está unido al brazo 1, 6 manosa (GnM) , y cualquier combinación de los mismos;

- una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o composición de glucoproteína de la invención;

- una célula hospedadora que comprende una composición de glucoproteína de la invención;

- una célula hospedadora que comprende los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina que codifican un anticuerpo anti-CD30, donde dicha célula hospedadora carece... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo anti-CD30 glucosilado aislado, donde al menos el 90% es una única glucoforma, que carece de restos fucosilo y xilosilo.

2. Un anticuerpo anti-CD30 glucosilado aislado de acuerdo con la reivindicación 1 que no contiene restos galactosilo.

3. Una composición de glucoproteína que comprende una composición de anticuerpo anti-CD30 que comprende un perfil de N-glucosilación donde al menos el 90% de las especies de N-glucanos presentes en dicho perfil son GlcNAc2Man3GlcNAc2 (G0) , comprendiendo dicho perfil una cantidad traza de especie de N-glucano precursor, donde dicha especie de N-glucano precursor se selecciona entre Man3GlcNAc2, GlcNac1Man3GlcNAc2 donde GlcNac1 está unido al brazo 1, 3 manosa (MGn) , GlcNac1Man3GlcNAc2 donde GlcNac1 está unido al brazo 1, 6 manosa (GnM) , y cualquier combinación de los mismos.

4. La composición de glucoproteína de la reivindicación 3, donde dicha composición de anticuerpo:

(a) comprende una región Fc seleccionada entre el grupo compuesto por una región de IgG, IgG2, IgG3, e IgG4;

(b) es un anticuerpo humano;

(c) es un anticuerpo humanizado o quimérico; tal como un anticuerpo humanizado o quimérico preparado a partir de un anticuerpo anti-CD30 de ratón seleccionado entre AC10, HeFi-1, Ber-H2, Ki-1, Ki-4, HRS-3, Irac, HRS-4, M44, M67 y Ber-H8;

(d) es un anticuerpo monoclonal;

(e) muestra afinidad de unión aumentada por un FcyRIII;

(f) potencia la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos de células que expresan CD30 de superficie celular; o

(g) muestra fagocitosis mediada por macrófagos aumentada.

5. La composición de glucoproteína de la reivindicación 3 o 4, donde la composición de anticuerpo comprende:

(a) una CDR1 de región variable de cadena pesada humana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID Nº 7, 8, y 9;

(b) una CDR2 de región variable de cadena pesada humana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID Nº 10, 11, y 12;

(c) una CDR3 de región variable de cadena pesada humana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID Nº 13, 14, y 15;

(d) una CDR1 de región variable de cadena ligera humana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID Nº 16, 17, y 18;

(e) una CDR2 de región variable de cadena ligera humana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID Nº 19, 20, y 21;

(f) una CDR3 de región variable de cadena ligera humana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID Nº 22, 23, y 24.

6. La composición de glucoproteína de la reivindicación 5, donde la composición de anticuerpo comprende:

(a) una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 7; una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 10, una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 13, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 16, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 19 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 22;

(b) una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 8, una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 11, una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 14, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 17, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 20 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 23;

(c) una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 9, una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 12, una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº 15, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 18, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 21 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº 24; o

(d) una región variable de cadena pesada humana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID Nº; 1, 2 y 3 y una región variable de cadena ligera humana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID Nº 4, 5 y 6.

7. La composición de glucoproteína de la reivindicación 6, donde:

(a) la región variable de cadena pesada de la composición de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 y la región variable de cadena ligera de la composición de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 4;

(b) la región variable de cadena pesada de la composición de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 y la región variable de cadena ligera de la composición de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 5; o

(c) la región variable de cadena pesada de la composición de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 3 y la región variable de cadena ligera de la composición de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 6.

8. La composición de glucoproteína de la reivindicación 4, donde la composición de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que es un producto de o se obtiene de un gen humano VH 4-34 o VH 3-07 y/o una región variable de cadena ligera que un producto de o se obtiene de un gen humano VK L15, A27 o L6.

9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 o 2 o la composición de glucoproteína de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8.

10. Una célula hospedadora que comprende la composición de glucoproteína de la reivindicación 4, donde la célula hospedadora es opcionalmente una célula hospedadora vegetal como una célula de lenteja acuática.

11. Una célula hospedadora que comprende genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera que codifican un anticuerpo anti-CD30, donde dicha célula hospedadora carece de una fucosiltransferasa y una xilosiltransferasa de modo que el anticuerpo anti-CD30 expresado por dicha célula hospedadora carece de restos fucosilo y xilosilo, donde la célula hospedadora es opcionalmente una célula vegetal, donde la célula vegetal es opcionalmente un miembro de la familia Lemna minor.

12. La célula hospedadora de la reivindicación 11, donde:

(a) los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera son genes de inmunoglobulina humana de cadena y ligera; o

(b) dicha fucosiltransferasa es FucT y dicha xilosiltransferasa es XylT.

13. Un método in vitro para inhibir el crecimiento de células CD30+ tales como células tumorales que comprende poner en contacto dichas células con un anticuerpo anti-CD30, donde al menos el 90% es un única glucoforma, que carece de restos fucosilo y xilosilo, en condiciones suficientes para inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de dichas células.

14. Un anticuerpo anti-CD30, donde al menos el 90% es una única glucoforma, que carece de restos fucosilo y xilosilo, para su uso en un método para inhibir el crecimiento de células tumorales que expresan CD30 o en un método para tratar un trastorno autoinmune.

15. El método de la reivindicación 13 o el anticuerpo de la reivindicación 14, donde dicho anticuerpo anti-CD30 es un anticuerpo humano.

16. El anticuerpo de la reivindicación 14 ó 15, donde las células tumorales son de una enfermedad seleccionada entre enfermedad de Hodgkin (HD) , linfoma de células grandes anaplásicas (ALCL) , linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt, linfomas cutáneos de células T, linfomas de células escindidas pequeñas nodulares, linfomas linfocíticos, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticos, leucemia/linfomas de células T (ATLL) , leucemia de células T en el adulto (T-ALL) , cánceres de linfomas foliculares entroblásticos/centrocíticos (cd/cc) , linfomas de células T grandes difusas de linaje B, linfoma de células T tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD) , linfoma de células T en el adulto (ATL) , linfomas basados en cavidad corporal asociada con VIH, carcinomas embrionarios, carcinomas indiferenciados de la rinofaringe (por ejemplo, tumor de Schmincker) , enfermedad de Castleman, sarcoma de Kaposi, linfomas de células T CD30+ y linfomas de células B CD30+.

5F11 anti-CD30 VH Segmento V: Locus: 4-34 Segmento D: Locus - 7-27 Segmento J: JH4b

5F11 anti-CD30 VL Segmento V: Locus: L15 Segmento J: JK5

17G1 anti-CD30 VH Segmento V: Locus: 3-07 Segmento D: No encontrado Segmento J: JH2

17G1 anti-CD30 VL Segmento V: Locus: A27 Segmento J: JK1

2H9 anti-CD30 VH Segmento V: Locus: 4-34 Segmento D: Locus - 5-12 Segmento J: JH2

2H9 anti-CD30 VL Segmento V: Locus: L6 Segmento J: JK1