Ácidos nucleicos que codifican las secuencias de inmunoglobulina humana reorganizadas a partir de ratones transcromoscómicos transgénicos zadas.

Procedimiento para producir ácidos nucleicos de inmunoglobulina humana reorganizados que comprendeobtener ácidos nucleicos de inmunoglobulina humana reorganizados a partir de un ratón transgénico que comprendedos loci de inmunoglobulina humana,

en el que un locus de inmunoglobulina humana es un locus de cadena pesadahumana ubicado sobre un fragmento del cromosoma humano 14 en el interior de un transcromosoma y el otro locusde inmunoglobulina humana es una parte de un transgén de locus de cadena ligera humana integrado de maneraestable en el interior del genoma del ratón.

Ácidos nucleicos que codifican las secuencias de inmunoglobulina humana reorganizadas a partir de ratones transcromosómicos transgénicos.

Campo técnico

La invención se refiere a los campos técnicos de los animales transgénicos, la inmunología molecular y la medicina.

Antecedentes de la invención Los anticuerpos representan una clase de moléculas terapéuticas con aplicaciones en muchas áreas diferentes, que comprenden el trasplante, las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades infecciosas, el cáncer y la autoinmunidad (Goldenberg, M., Clin. Ther. 21:309-318, 1999; Present, D. et al., New Engl. J. Med. 340:1398-1405, 1999; Targan, S. et al., New Engl. J. Med. 337:1029-1035, 1997; Davis, T. et al., Blood 94:88a, 1999; Saez-Llorens,

X. et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 17:787-791, 1998; Berar, J. et al., Pharmacotherapy 19:1127-1137, 1999; Glennie, M. et al., Immunol. Today 21:403-410, 2000; Miller, R., New Engl. J. Med. 306:517-522, 1982; Maini, R. et al., Lancet 354:1932-1939, 1999) . El desarrollo de la tecnología del hibridoma ha permitido aislar anticuerpos monoclonales de roedor (también denominados MAbs) como moléculas terapéuticas candidatas (Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256:495-497, 1975) . Sin embargo, los primeros estudios que implicaban la utilización de anticuerpos monoclonales no humanos para la terapia in vivo en seres humanos, demostraron que las respuestas de anticuerpos humanos antirratón (HAMA) podrían limitar la utilización de dichos agentes (Schroff, R. et al., Cancer Res. 45:879-885, 1985; Shawler, D. et al., J. Immunol. 135:1530-1535, 1985) . De esta manera, se reconoce que una reducción de la inmunogenicidad de los anticuerpos terapéuticos resulta deseable. Se han utilizado tecnologías de ADN recombinante para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos no humanos (Boulianne, G. et al., Nature 312:643646, 1984; Morrison, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855, 1984; Riechmann, L. et al., Nature 332:323-327, 1988; Jones, P. et al., Nature 321:522-525, 1986; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033, 1989) . Sin embargo, también se reconoce que los anticuerpos monoclonales totalmente humanos son una fuente potencial de agentes terapéuticos de baja inmunogenicidad para tratar enfermedades humanas (Little, M. et al., Immunol. Today 21:364-370, 2000) . La utilización de ratones transgénicos que portan loci de inmunoglobulina (Ig) humana en la configuración de línea germinal de los mismos permiten el aislamiento de anticuerpos monoclonales completamente humanos de alta afinidad dirigidos contra una diversidad de dianas, incluyendo autoantígenos humanos para los que el sistema inmunológico humano normal es tolerante (Lonberg, N. et al., Nature 368:856-859, 1994; Green, L. et al., Nature Genet. 7:13-21; Green, L. & Jakobovits, Exp. Med. 188:483-495, 1998; Lonberg, N. y Huszar, D., Int. Rev. Immunol. 13:65-93, 1995; Bruggemann, M. et al., Eur. J. Immunol. 21:1323-1326, 1991; Fishwild, D. et al., Nat. Biotechnol. 14:845-851, 1996; Mendez, M. et al., Nat. Genet. 15:146-156, 1997; Green, L., J. Immunol. Methods 231:11-23, 1999; Yang, X. et al., Cancer Res. 59:1236-1243, 1999; Brüggemann, M. y Taussig, M.J., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458, 1997) . Los anticuerpos humanos se clasifican en una diversidad de clases diferentes basándose en la cadena ligera (kappa y lambda) y en la cadena pesada (IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM) . Estas diferentes clases proporcionan potencialmente diferentes usos terapéuticos. Por ejemplo, los diferentes isotipos de cadena pesada presentan diferentes interacciones con el complemento y con receptores Fc en células. Algunas de las clases de cadena pesada (IgM e IgA) también pueden formar multímeros, incrementando de esta manera la valencia de Fc y las interacciones de la región V. Por lo tanto, resulta deseable disponer de una plataforma para generar anticuerpos monoclonales humanos de todos los isotipos. Sin embargo, el gran tamaño de los loci de Ig humanos (1 a 2 Mb) ha sido un obstáculo importante para la introducción de loci enteros en ratones transgénicos para reconstituir repertorios diversos completos de anticuerpos humanos debido a que la clonación de fragmentos de ADN de tamaño superior a una megabase que comprenden loci de Ig humanos completos resulta difícil incluso con la utilización de cromosomas artificiales de levadura. Recientemente, un nuevo procedimiento que utilizaba un cromosoma humano como vector para la transgénesis facilitó la transferencia de los loci IgH e Igκ en ratones transgénicos sin necesidad de clonar fragmentos de ADN en vectores de ADN artificiales (Tomizuka, K. et al., Nature Genet. 16:133-143, 1997; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97:722-727, 2000) . Tomizuka et al. (Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727, 2000) demostraron la introducción de dos fragmentos transmisibles de cromosoma humano (hCFs) , uno que contenía el locus de cadena pesada de inmunoglobulina (Ig) (IgH, ∼1, 5 Mb) y el otro el locus de cadena ligera κ (Igκ, ∼2 Mb) , en una cepa de ratón transgénico cuyos loci IgH e Igκ endógenos habían sido inactivados. En los ratones doble-transcromosómicos (Tc) /de inactivación génica (KO) , una proporción sustancial de las células somáticas conservaba ambos hCFs, y el rescate del defecto de producción de Ig se demostró a partir de la expresión de nivel elevado de las cadenas pesada y ligera kappa de Ig humanas en ausencia de cadenas pesada y ligera kappa de ratón. Además, los perfiles de expresión sérica de cuatro subclases de Igγ humanas eran similares a los observados en el ser humano. Los ratones transgénicos desarrollaron una respuesta de anticuerpos humanos antígeno-específicos tras la inmunización con albúmina sérica humana (HSA) y se obtuvieron a partir de ellos anticuerpos monoclonales humanos HSA-específicos con diversos isotipos. El estudio de Tomizuka et al. (ibid.) también demostró la inestabilidad de hCF derivado de hChr.2 que contenía el locus de Igκ (hCF (2-W23) ) en ratones. La inestabilidad observada del transcromosoma κ podría ser un impedimento para la expresión óptima de cadena ligera kappa humana y para la producción de hibridomas positivos para kappa humana. En efecto, dos tercios de los hibridomas anti-HSA obtenidos a partir de un ratón doble-Tc/KO eran positivos para lambda de ratón (mλ+) y la mayoría (83%) de hibridomas IgG/mλ se observó que habían perdido el locus hCF (2-W23) . Por lo tanto, existe una necesidad de animales transgénicos que conserven las características proporcionadas por los transcromosomas descritos por Tomizuka et al. (ibid.) , particularmente de animales que expresen sustancialmente el repertorio completo de isotipos de cadena pesada humana y que también muestren una mejor estabilidad de las secuencias humanas introducidas, proporcionando una eficiencia incrementada de obtención de anticuerpos humanos completos.

Breve sumario de la invención La invención proporciona unos procedimientos como son definidos en las reivindicaciones adjuntas.

Los procedimientos de la invención utilizan un ratón transgénico que comprende dos loci de inmunoglobulina humana, en los que uno de dichos dos loci de inmunoglobulina humana es un locus de cadena pesada humana y el otro locus es un locus de cadena ligera humana; y en los que el locus de cadena pesada es de un transcromosoma. En algunos ratones transgénicos, el transcromosoma es autónomo. En los ratones transgénicos, el transcromosoma comprende un fragmento del cromosoma humano 14, y el locus de cadena ligera humana se encuentra asociado con un cromosoma de mamífero endógeno. Po lo tanto, el locus de cadena pesada humana es de un transcromosoma y el locus de cadena ligera humana se encuentra asociado con un cromosoma de mamífero endógeno. En algunos de dichos ratones transgénicos, por lo menos una parte del locus de cadena ligera humana se clona en un vector YAC. En algunos ratones transgénicos, el locus de cadena pesada humana se encuentra comprendido en hCF (SC20) y el locus de cadena ligera humana se encuentra comprendido en el transgén Kco5 de locus de la cadena ligera kappa humana. En determinados ratones transgénicos, el locus endógeno de cadena pesada de mamífero y por lo menos un locus de cadena ligera de mamífero se encuentran inactivados. En algunos de estos ratones transgénicos, el locus endógeno de cadena pesada de mamífero y el locus de cadena ligera kappa se encuentran inactivados.

En otro aspecto, los ratones transgénicos comprenden además una mutación de un gen, en el que la mutación incrementa la respuesta inmunológica frente a un autoantígeno. En algunos ratones transgénicos, la mutación es la inactivación... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para producir ácidos nucleicos de inmunoglobulina humana reorganizados que comprende obtener ácidos nucleicos de inmunoglobulina humana reorganizados a partir de un ratón transgénico que comprende dos loci de inmunoglobulina humana, en el que un locus de inmunoglobulina humana es un locus de cadena pesada humana ubicado sobre un fragmento del cromosoma humano 14 en el interior de un transcromosoma y el otro locus de inmunoglobulina humana es una parte de un transgén de locus de cadena ligera humana integrado de manera estable en el interior del genoma del ratón.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de obtención comprende aislar los linfocitos células B que contienen los ácidos nucleicos de inmunoglobulina humana reorganizados a partir del ratón transgénico.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de obtención comprende aislar y amplificar el ARNm

de los linfocitos células B para generar ADNc. 15

4. Procedimiento según la reivindicación 3, que comprende además aislar y amplificar las secuencias de región variable de cadena ligera y pesada a partir del ADNc.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además expresar el ARNm a partir de los ácidos 20 nucleicos de inmunoglobulina humana reorganizados en una célula transfectada.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de obtención comprende unir funcionalmente los ácidos nucleicos de inmunoglobulina humana reorganizados obtenidos a partir del ratón transgénico a una secuencia reguladora que controla la expresión de los ácidos nucleicos en una célula huésped;

cultivar la célula huésped en condiciones tales que el ARNm es expresado a partir de los ácidos nucleicos; y

aislar el ARNm de la célula huésped cultivada o su medio cultivado.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de obtención comprende introducir un inmunógeno en el ratón transgénico;

aislar una población de ácidos nucleicos de inmunoglobulina humana reorganizados a partir de células linfácticas 35 del ratón transgénico; y

clonar la población aislada de ácidos nucleicos en una colección de los miembros de una biblioteca de expresión en fago para formar una biblioteca de fago que expresa las cadenas de anticuerpo humanas, en el que cada miembro de la biblioteca de expresión en fago comprende un ácido nucleico de inmunoglobulina humana reorganizado que codifica una cadena de anticuerpo humana, y la cadena de anticuerpo humana es expresada a partir del paquete de fago; y

en el que el ácido nucleico de inmunoglobulina humana reorganizado es aislado a partir del miembro de la biblioteca de expresión en fago que puede unirse al inmunógeno.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el ratón transgénico carece de un valor de anticuerpo detectable para el inmunógeno cuando es realizada la etapa de aislamiento de una población de ácidos nucleicos de inmunoglobulina humana reorganizados a partir de las células linfáticas del ratón transgénico.

9. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el inmunógeno es un ácido nucleico.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el ácido nucleico codifica un receptor unido a la membrana.

11. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el ratón transgénico comprende además una mutación en un 55 gen que aumenta la respuesta inmunitaria al autoantígeno.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la mutación inactiva el gen Fc-γIIB

13. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de obtención comprende

introducir un inmunógeno en el ratón transgénico;

aislar una población de ácidos nucleicos de inmunoglobulina humana reorganizados a partir de células linfáticas del ratón transgénico;

clonar los ácidos nucleicos de inmunoglobulina humana reorganizados aislados en un vector para generar una biblioteca de expresión; y

expresar la biblioteca para identificar los ácidos nucleicos de inmunoglobulina humana reorganizados que codifican 5 una secuencia de anticuerpos humana o un fragmento de la misma que se une al antígeno predeterminado; y

en el que los ácidos nucleicos de inmunoglobulina humana reorganizados son aislados de un miembro de la biblioteca.

14. Procedimiento para generar un anticuerpo de secuencia humana o fragmento del mismo que se une a un antígeno predeterminado, comprendiendo el procedimiento:

clonar un ácido nucleico que codifica por lo menos una región V de anticuerpo humano en un vector de expresión, en el que el ácido nucleico aislado es de una célula B de un ratón transgénico que comprende dos loci de inmunoglobulina humana, en el que un locus de inmunoglobulina humana es un locus de cadena pesada humana ubicado sobre un fragmento del cromosoma 14 humano en el interior de un transcromosoma y el otro locus de inmunoglobulina humana es un transgén de locus de cadena ligera humana integrado de manera estable en el interior del genoma del ratón, en el que el ratón transgénico es inmunizado con un antígeno predeterminado, o de un hibridoma generado por la fusión de la célula B y un célula inmortalizada;

introducir el vector en una célula huésped; cultivar la célula huésped en condiciones tales que la secuencia de ácido nucleico clonada es expresada;

cribar el anticuerpo expresado o su fragmento para identificar su capacidad de unirse al antígeno predeterminado; 25 y

aislar el anticuerpo de secuencia humana o fragmento del mismo que puede unirse al antígeno predeterminado de dicha célula huésped o su medio de cultivo.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el ácido nucleico es el ADNc.

16. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el ácido nucleico es aislado mediante PCR.

17. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el ácido nucleico es aislado mediante cribado de biblioteca 35 de ADNc utilizando por lo menos una sonda de ácido nucleico.

18. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el ácido nucleico es aislado mediante cribado de biblioteca de expresión en fago.

19. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el ácido nucleico codifica las secuencias de anticuerpo humanas de longitud completa.

20. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el isotipo de anticuerpo de secuencia humana aislado es diferente al isotipo de anticuerpo que produce células del ratón transgénico inmunizado. 45

21. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el ratón transgénico comprende además una mutación en un gen que aumenta la respuesta imunitaria al autoantígeno.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que la mutación inactiva el gen Fc-γIIB. 50