VECTOR DE EXPRESIÓN.

La presente invención se refiere a vectores para la alta expresión de uno o más genes de interés en células huéspedes tales como células de mamíferos y similares. Antecedentes de la invención La producción estable de un gen de interés (GDI) puede conseguirse transfectando células huéspedes con vectores que contienen el GDI conjuntamente unido con un gen marcador de selección y seleccionando para determinar células que contienen el GDI causando una tensión en la célula que solo puede disminuirse si la célula expresa cantidades suficientes del marcador de selección. Los vectores integran al azar ADN cromosómico en las células huéspedes y los transfectantes resultantes muestran un amplio grado de variación en el nivel de expresión del GDI. Sin embargo, debido al efecto posicional del sitio de integración, relativamente pocos clones de células transfectantes expresarán el GDI a los niveles más altos deseados. El nivel de expresión de los genes codificados por el vector está muy influenciado por el entorno cromosómico local en el sitio de integración de los genes (Barnet y col., 1995, Antibody Expression and Engineering, Wang and Imanaka (eds.), ACS Symposia Series, pág. 604). El uso de un marcador de selección atenuado se ha correlacionado con un cambio hacia la obtención de transfectantes con mayores niveles de expresión del GDI unido, presumiblemente por sesgo de selección para posiciones de integración que poseen influencias positivas sobre la expresión del gen marcador de selección atenuado y el GDI conjuntamente unido (Reff y Pfarr, 1992, Gene Amplification in Mammalian Cells, R. E. Kellens (ed.), Marcel Dekker, Inc., pág.355). Los vectores de expresión descritos típicamente en la técnica anterior, contienen fuertes elementos reguladores para impulsar un alto nivel de expresión de proteína del GDI que está conjuntamente unido con un marcador de selección atenuado. Anteriormente se han utilizado estrategias para la reducción de marcadores de selección en vectores de expresión que incluyen mutaciones incapacitantes de proteínas de marcadores de selección (por ejemplo, documento US 6.316.253), inserciones intrónicas artificiales en el gen marcador de selección (por ejemplo, documento US 5. 733.779) y expresión reducida de marcadores de selección en construcciones de vectores policistrónicos (por ejemplo, documento US 4. 713.339 y Rees S al., 1996, Biotechniques 20:102). Aunque cada uno de estos sistemas para mejorar la expresión de los genes de interés puede tener problemas asociados con ellos, es deseable tener un sistema de expresión mejorado que permita un procedimiento más eficaz para generar y explorar células que sean grandes productoras del producto génico de interés. De esta manera, es deseable crear un vector de expresión y sistema de expresión en células huésped mejorados que puedan usarse para generar eficazmente altas cantidades de cualquier proteína recombinante mediante el aumento de la expresión estable de un gen de interés por una célula huésped. La cita bibliográfica y/o mención de una referencia en esta sección y a lo largo de la memoria descriptiva se proporciona simplemente para aclarar la descripción de la presente invención y no es una admisión de que cualquier referencia de este tipo sea "técnica anterior" con respecto a la invención descrita en el presente documento. Sumario de la invención La presente invención proporciona vectores de expresión novedosos que son capaces de producir, en una célula huésped, particularmente en células de mamíferos, grandes cantidades de una o más proteínas deseadas. En un aspecto, la presente invención se refiere a vectores de expresión. En una realización, el vector de expresión contiene un gen marcador de selección unido operativamente a un ácido nucleico regulador que comprende un promotor transcripcionalmente defectuoso y uno o más sitios de inserción para insertar un gen de interés unido conjuntamente que se une operativamente a secuencia reguladora. En otra realización, el vector de expresión contiene un gen marcador de selección unido operativamente a un ácido nucleico regulador que comprende un promotor del gen de la beta globina que carece de una secuencia de caja CCAAT y uno o más genes de interés unidos operativamente a un ácido nucleico regulador. En algunas realizaciones, los vectores de expresión también poseen un gen marcador amplificable. En otro aspecto, la invención se refiere a células huéspedes que se han transfectado con un vector de expresión de la presente invención. En una realización particular la célula huésped es una célula de mamífero, por ejemplo, una célula CHO. En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a procedimientos para producir un polipéptido codificado por un gen de interés, que comprende cultivar una célula huésped, que contiene un vector de expresión de la presente invención, en condiciones adecuadas de tal manera que el gen de interés exprese el polipéptido. En realizaciones particulares, los procedimientos de la presente invención producen una cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena ligera de inmunoglobulina, dando así como resultado un anticuerpo funcional. 2 E04783263 27-12-2011   Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción y ejemplos detallados más adelante que no deben interpretarse como limitantes. Breve descripción de los dibujos Las Figuras 1A-1B muestran la secuencia de un fragmento de ADN (SEC ID Nº: 1) que contiene, de 5 a 3, un promotor principal de beta-globina murina, un gen de DHFR, una secuencia poli A del SV40, un segundo promotor principal de la beta globina murina y una parte de un gen de neo. La Figura 2 muestra las secuencias del promotor principal de la beta globina murina pAGE2 (SEC ID Nº: 2) y los promotores principales de la beta globina murina modificados pAGE8 y pAGE9 (SEC ID Nº: 3 y 4). Las secuencias reguladoras transcripcionales CACCC, CCAAT y TATA están subrayadas. Los elementos de repetición directos están subrayados con líneas dobles. La Figura 3 es un histograma en el que se compara el número de colonias obtenidas, transfectando células CHO con los vectores pAGE2 (barras de color blanco), pAGE8 (barras de color gris) o pAGE9 (barras de color negro), con sus niveles de expresión de proteína (en ng/ml). La Figura 4 es un diagrama esquemático del vector pIE-Ugamma1. La Figura 5 es un histograma en el que se compara el número de colonias obtenidas, transfectando células CHO con un vector pIE, que tiene la misma modificación que la del promotor de la beta la globina encontrado en pAGE9, con los niveles de expresión de anticuerpos (en ng/ml). Descripción detallada de la invención La presente invención proporciona vectores para altos niveles de expresión de un gen de interés (GDI). Los vectores de la presente invención están particularmente bien adaptados para la expresión de anticuerpos recombinantes (por ejemplo, cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos incluidas en el mismo vector de expresión) y que pueden usarse para obtener niveles de expresión de anticuerpos en el intervalo, por ejemplo, de 3-14 pg/cél/día. En los vectores de la presente invención, se consiguen altos niveles de expresión de proteínas mediante la unión conjunta del gen de interés (que codifica la proteína) con un gen marcador de selección que tiene un promotor transcripcionalmente defectuoso. En otra realización, el marcador de selección unido operativamente al promotor transcripcionalmente defectuoso se usa en combinación con otro marcador de selección que es amplificable para conseguir niveles de expresión, incluso más altos, del gen de interés. El alto nivel de expresión incluso estable de genes en células de mamíferos depende críticamente tanto del sitio de integración como del número de copias. La presión de selección impuesta por concentraciones convencionales del análogo de la neomicina G418, por ejemplo, es típicamente baja y produce clones celulares que tienen una amplia distribución de niveles expresión con escasísimos clones que tienen mayores niveles de expresión a los típicamente deseables para propósitos de producción de proteínas recombinantes. Los ácidos nucleicos y vectores de expresión descritos en el presente documento resuelven éste y otros problemas usando un marcador de selección unido operativamente a un promotor atenuado que está conjuntamente unido a un GDI. La expresión notablemente baja del gen marcador de selección permite una selección parcial hacia clones de alta expresión. La presente invención proporciona nuevas construcciones de ácidos nucleicos (vectores de expresión) que son útiles para la expresión estable, a alto nivel, de un GDI heterólogo en una célula huésped, particularmente en células de mamíferos. En... [Seguir leyendo]

1. Un vector de expresión que comprende, (i) un gen marcador de selección unido operativamente a un ácido nucleico regulador que comprende un promotor del gen de la beta globina y (2) uno o más genes de interés unidos operativamente a un segundo ácido nucleico regulador, en el que el promotor de la beta globina comprende la secuencia expuesta en la SEC ID Nº:4 (como se muestra en la Figura 2) y en el que uno o más genes de interés codifican una cadena pesada de inmunoglobulina y/o una cadena ligera de inmunoglobulina. 2. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el gen marcador de selección es una neomicina fosfotransferasa. 3. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el gen marcador de selección se selecciona de glutamina sintetasa, dihidrofolato reductasa, cloramfenicol acetiltransferasa, higromicina B fosfotransferasa, xantina-guanina fosforibosiltransferasa, histidinol deshidrogenasa, la subunidad ß de la triptófano sintasa, blasticidina S desaminasa, zeocina, asparagina sintasa, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa, timidina quinasa, adenina fosforibosiltransferasa, P-glucoproteína, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, CAD (carbamoil-Psintetasa, aspartato transcarbamilasa, dihidroorotasa). 4. El vector de expresión de cualquier reivindicación anterior que adicionalmente comprende un segundo marcador de selección que facilita la selección de células huéspedes que expresan dicho uno o más genes de interés. 5. El vector de expresión de la reivindicación 4, en el que el segundo marcador de selección se selecciona de dihidrofolato reductasa, P-glucoproteína, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa o CAD (carbamoil-P- sintetasa, aspartato transcarbamilasa, dihidroorotasa). 6. El vector de expresión de cualquier reivindicación anterior, en el que el vector de expresión comprende dos genes de interés. 7. Una célula huésped transfectada con un vector de expresión de cualquier reivindicación anterior. 8. La célula huésped de la reivindicación 7, en la que el vector de expresión se integra establemente en un cromosoma de la célula huésped. 9. La célula huésped de la reivindicación 7 que es una célula de mamífero. 10. La célula huésped de la reivindicación 7 que es una célula de ovario de hámster chino. 11. Un procedimiento de cultivo de la célula de la reivindicación 7, en condiciones adecuadas de tal manera que se exprese el gen de interés. 12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que las condiciones adecuadas permiten al vector de expresión integrarse establemente en un cromosoma de la célula. 13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que las condiciones adecuadas comprenden adicionalmente poner en contacto la célula con un compuesto que selecciona para la expresión del gen marcador de selección. 14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el vector de expresión comprende adicionalmente un segundo gen marcador de selección y en el que las condiciones adecuadas comprenden adicionalmente poner en contacto la célula con un compuesto que selecciona para la expresión del segundo gen marcador. 15. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que se recupera la cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina. E04783263 27-12-2011   16 E04783263 27-12-2011   17 E04783263 27-12-2011   18 E04783263 27-12-2011   19 E04783263 27-12-2011   E04783263 27-12-2011   21 E04783263 27-12-2011