Un método para marcar una bacteria que comprende las etapas de:

(a) exponer una bacteria original que comprende un locus CRISPR a un bacteriófago para introducir una unidad adicional de repetición espaciador dentro del locus CRISPR, para producir una bacteria marcada, en donde la unidad adicional de repetición-espaciador proporciona el marcador; (b) seleccionar un mutante insensible a los bacteriófagos; (c) comparar un locus CRISPR o una porción del mismo procedente de la bacteria original y del mutante insensible a los bacteriófagos (d) seleccionar una bacteria marcada que comprende dicha unidad adicional de repetición-espaciador en el locus CRISPR que no está presente en la bacteria original

Microorganismos marcados y métodos para marcar.

Campo de la invención La presente invención proporciona métodos para marcar microorganismos. En algunas realizaciones preferidas, los microorganismos son bacterias. En algunas realizaciones particularmente preferidas, las bacterias son miembros del género Streptococcus, mientras que en otras realizaciones, las bacterias son miembros de otros géneros. Los microorganismos marcados empleando los métodos descritos en esta memoria, se exponen en esta memoria. En algunas realizaciones preferidas, los microorganismos marcados son bacterias. En algunas realizaciones particularmente preferidas, las bacterias marcadas son miembros del género Streptococcus, mientras que en otras realizaciones las bacterias marcadas son miembros de otros géneros.

Antecedentes de la invención

Las cepas microbianas, especialmente las empleadas como cultivos iniciadores para la fermentación en la industria alimentaria/de bebidas, están muy seleccionadas y caracterizadas para funciones específicas. Típicamente, estos cultivos iniciadores se venden en el comercio como organismos vivos y a menudo siguen siendo viables en el producto final. Por lo tanto, es posible aislar, identificar y caracterizar las cepas de los cultivos iniciadores, mediante el cultivo de los microorganismos presentes en los productos finales. Además, también es posible utilizar a continuación esas cepas de cultivo iniciador en otros productos, incluyendo productos de la competencia. Es difícil controlar el uso de tales cepas por parte de terceros, incluidos los competidores. De hecho, en la técnica existe una falta de métodos para marcar fácilmente los cultivos, con el fin de identificar su (s) fuente (s) y vigilar su uso en diferentes productos.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona métodos para marcar microorganismos. En algunas realizaciones preferidas, los microorganismos son bacterias. En algunas realizaciones particularmente preferidas, las bacterias son miembros del género Streptococcus, mientras que en otras realizaciones, las bacterias son miembros de otros géneros. Los microorganismos marcados empleando los métodos descritos en esta memoria, también se exponen. Los microorganismos marcados pueden ser bacterias. Las bacterias marcadas pueden ser miembros del género Streptococcus o ser miembros de otros géneros.

La presente invención proporciona un método tal y como se describe en la reivindicación 1

Los productos alimenticios y/o los piensos que comprenden la bacteria marcada y/o cultivos celulares que comprenden al menos una especie bacteriana marcada, también se describen en esta memoria. Los procedimientos para preparar productos alimenticios y/o piensos que comprenden bacterias marcadas y/o cultivos celulares que comprenden al menos una especie bacteriana marcada, también se describen en esta memoria. Los métodos para preparar alimentos y/o piensos que comprenden la etapa de añadir la bacteria marcada o el cultivo celular a dicho producto alimenticio o pienso, también se describen en esta memoria. Los alimentos y/o los piensos obtenidos u obtenibles empleando los métodos de la presente invención, también se describen.

En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona métodos para generar variantes de CRISPR, tal y como se describe en la reivindicación 19. Las variantes de CRISPR obtenidas u obtenibles empleando los métodos de la presente invención, se describen en esta memoria Los métodos para identificar una bacteria marcada que comprenden las etapas de: (a) escrutar la bacteria en busca de una unidad adicional de repetición-espaciador en un locus CRISPR; (b) determinar la secuencia de nucleótidos de la unidad adicional de repetición-espaciador; (c) comparar la secuencia de nucleótidos de la unidad de repeticiónespaciador adicional con una base de datos de bacterias marcadas, obtenidas u obtenibles por el método de la presente invención; e (d) identificar una secuencia de nucleótidos en la base de datos de las bacterias marcadas que se empareja con la unidad adicional de repetición-espaciador, también se describen en esta memoria.

En algunas realizaciones, se compara el extremo 5' y/o el extremo 3' del locus CRISPR de la bacteria original. En algunas realizaciones particularmente preferidas, se comparan al menos la primera repetición de CRISPR y/o el primer espaciador de CRISPR (p. ej., la primera agrupación de espaciadores de CRISPR) en el extremo 5' del locus CRISPR. En aún otras realizaciones, se compara al menos la última repetición de CRISPR y/o el último espaciador de CRISPR (p. ej., la última agrupación de espaciadores de CRISPR) en el extremo 3' del locus CRISPR. En otras realizaciones preferidas de los métodos de la presente invención, los métodos comprenden la etapa de seleccionar una bacteria marcada que comprende una unidad adicional de repetición-espaciador en el extremo 5' y/o en el extremo 3' del locus CRISPR que no está presente en la bacteria original. En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención comprenden la exposición de la bacteria original a dos o más bacteriófagos de forma simultánea o secuencial.

En algunas realizaciones adicionales, se compara el locus CRISPR o al menos una porción del mismo procedente de la bacteria original y del mutante insensible a los bacteriófagos, amplificando el locus CRISPR o una porción del mismo procedente de la bacteria original y/o del mutante insensible a los bacteriófagos. En algunas realizaciones preferidas, la amplificación se realiza empleando la PCR. En algunas realizaciones adicionales, se compara el locus CRISPR o al menos una porción del mismo procedente de la bacteria original y del mutante insensible a los bacteriófagos, secuenciando el locus CRISPR o una porción del mismo procedente de la bacteria original y/o del mutante insensible a los bacteriófagos. En algunas realizaciones particularmente preferidas, se compara el locus CRISPR o al menos una porción del mismo procedente de la bacteria original y el mutante insensible a los bacteriófagos, amplificando y secuenciando a continuación el locus CRISPR o una porción del mismo procedente de la bacteria original y/o del mutante insensible a los bacteriófagos. En algunas realizaciones, la unidad adicional de repetición-espaciador tiene al menos 44 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones adicionales, se selecciona una bacteria marcada que comprende dos, tres o más unidades adicionales de repetición-espaciador. En algunas realizaciones preferidas, la unidad adicional de repetición-espaciador comprende al menos una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad, o más preferentemente, aproximadamente 100% de identidad con una repetición de CRISPR en el locus CRISPR de la bacteria original. En algunas realizaciones preferidas alternativas, la unidad adicional de repetición-espaciador comprende al menos una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad, preferentemente, 100% de identidad con una secuencia de nucleótidos en el genoma del bacteriófago utilizado para la selección de la bacteria marcada.

En algunas realizaciones alternativas preferidas, la unidad adicional de repetición-espaciador comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad o, más preferentemente, aproximadamente 100% de identidad con una repetición de CRISPR en el locus CRISPR de la bacteria original, y una segunda secuencia de nucleótidos que tiene al menos una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad o, con preferencia, aproximadamente 100% de identidad con una secuencia de nucleótidos en el genoma del bacteriófago utilizado para la selección de la bacteria marcada.

Los métodos para identificar una bacteria marcada pueden comprender la etapa adicional de comparar la unidad adicional de repetición-espaciador con una base de datos de secuencias de bacteriófagos y/o una base de datos de secuencias bacterianas.

En algunas realizaciones preferidas, la bacteria original es adecuada para el uso como cultivo iniciador, cultivo probiótico y/o suplemento dietético. En algunas realizaciones preferidas, la bacteria original se selecciona entre el grupo de géneros consistente en: Escherichia, Shigella, Salmonella, Erwinia, Yersinia, Bacillus, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Agrobacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Cor y nebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Francisella, Brucella, Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium,... [Seguir leyendo]

1. Un método para marcar una bacteria que comprende las etapas de:

(a) exponer una bacteria original que comprende un locus CRISPR a un bacteriófago para introducir una unidad adicional de repetición espaciador dentro del locus CRISPR, para producir una bacteria marcada, en donde la unidad adicional de repetición-espaciador proporciona el marcador;

(b) seleccionar un mutante insensible a los bacteriófagos;

(c) comparar un locus CRISPR o una porción del mismo procedente de la bacteria original y del mutante insensible a los bacteriófagos

(d) seleccionar una bacteria marcada que comprende dicha unidad adicional de repetición-espaciador en el locus CRISPR que no está presente en la bacteria original.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se compara el extremo 5' y/o el extremo 3' del locus CRISPR de la bacteria original.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que se compara al menos la primera repetición de CRISPR o el primer espaciador de CRISPR en el extremo 5' del locus CRISPR.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se compara al menos la última repetición de CRISPR o el último espaciador de CRISPR en el extremo 3' del locus CRISPR.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende la etapa de seleccionar una bacteria marcada que comprende una unidad adicional de repetición-espaciador en el extremo 5' y/o en el extremo 3' del locus CRISPR que no está presente en la bacteria original.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho método comprende exponer la bacteria original a dos o varios bacteriófagos, de forma simultánea o sucesiva.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el locus CRISPR o una porción del mismo procedente de la bacteria original y del mutante insensible a los bacteriófagos se comparan mediante la amplificación de dicho locus CRISPR o de una porción del mismo procedente de dicha bacteria original y/o de dicho mutante insensible a los bacteriófagos.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la amplificación se realiza empleando PCR.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el locus CRISPR o una porción del mismo procedente de la bacteria original y el mutante insensible a los bacteriófagos se comparan mediante la secuenciación de dicho locus CRISPR o de una porción del mismo procedente de dicha bacteria original y/o de dicho mutante insensible a los bacteriófagos.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el locus CRISPR o a una porción del mismo procedente de la bacteria original y del mutante insensible a los bacteriófagos se comparan amplificando y secuenciando después dicho locus CRISPR o a una porción del mismo procedente de dicha bacteria original y/o de dicho mutante insensible a los bacteriófagos.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la unidad adicional de repetición-espaciador tiene al menos 44 nucleótidos de longitud.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde en la etapa (d) se selecciona una bacteria marcada que comprende dos, tres o más unidades adicionales de repetición-espaciador.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la unidad adicional de repetición-espaciador comprende al menos una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 95%, preferentemente una identidad del 100% con una repetición de CRISPR en el locus CRISPR de la bacteria original.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la unidad adicional de repetición-espaciador comprende al menos una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 95%, preferentemente, una identidad del 100% con una secuencia de nucleótidos en el genoma del bacteriófago utilizado para la selección de la bacteria marcada.

15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la unidad adicional de repetición-espaciador comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos una identidad del 95%, preferentemente, una identidad del 100% con una repetición de CRISPR en el locus CRISPR de la bacteria original y una segunda secuencia de nucleótidos que tiene al menos una identidad del 95%, preferentemente, una identidad

del 100% con una secuencia de nucleótidos en el genoma del bacteriófago empleado para la selección de la bacteria marcada.

16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la bacteria original es adecuada para el uso como cultivo iniciador, cultivo probiótico o suplemento dietético.

17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la bacteria original se selecciona entre el grupo de géneros consistente en: Escherichia, Shigella, Salmonella, Erwinia, Yersinia, Bacillus, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Agrobacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Cor y nebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Francisella, Brucella, Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc

y Oenococcus.

18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el bacteriófago se selecciona entre el grupo de familias de virus consistente en: Corticoviridae, Cystoviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae y Tectiviridae.

19. Un método para generar una variante de CRISPR que comprende las etapas de:

(a) exponer una bacteria original que comprende un locus CRISPR a un bacteriófago para introducir una unidad adicional de repetición espaciador dentro del locus CRISPR, para producir una bacteria marcada, en donde la unidad adicional de repetición-espaciador proporciona el marcador;

(b) seleccionar una bacteria resistente a los bacteriófagos;

(c) comparar el locus CRISPR o una porción del mismo procedente de la bacteria original y del mutante insensible a 20 los bacteriófagos;

(d) seleccionar una bacteria marcada que comprende una unidad adicional de repetición-espaciador en el locus CRISPR que no está presente en la bacteria original; y

(e) aislar y/o clonar y/o secuenciar la unidad adicional de repetición-espaciador.