Procedimiento para la producción in situ de un emulsionante en un alimento que contiene agua,

en el que el procedimiento comprende la etapa que consiste en añadir una lípido aciltransferasa al alimento, en el que la lípido aciltransferasa está caracterizada como una enzima que presenta actividad de aciltransferasa y que comprende el motivo GDSX de la secuencia de aminoácidos, en el que X es uno o más de los restos de aminoácidos siguientes L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción in situ de un emulsionante en un alimento mediante la utilización de una lípido aciltransferasa.

La presente invención se refiere además a un procedimiento para la producción in situ de un emulsionante en un alimento mediante la utilización de una lípido aciltransferasa, en la que el procedimiento es tal que el emulsionante se produce sin aumentar o sin aumentar sustancialmente los ácidos grasos libres en el alimento.

La presente invención se refiere todavía además a un procedimiento para la producción in situ de por lo menos dos emulsionantes en un alimento mediante la utilización de una lípido aciltransferasa.

La presente invención se refiere además a un procedimiento para la producción in situ de un éster de carbohidrato y/o de un éster de esterol y/o un éster de estanol y/o un éster de proteína y/o un éster de glicerol y/o un éster de hidroxiácido en un alimento mediante la utilización de una lípido aciltransferasa.

La presente invención se refiere a la utilización de una composición enzimática alimenticia y/o de una composición enzimática para piensos, que contiene una lípido aciltransferasa, en los procedimientos de la presente invención.

Se da a conocer un procedimiento de identificación de lípido aciltransferasas adecuadas según la presente invención, lípido aciltransferasas así identificadas y una lípido aciltransferasa inmovilizada.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

La utilización provechosa de las fosfolipasas y de las lipasas (denominadas enzimas lipolíticas, (EC.3.1.1.x) utilizadas en aplicaciones industriales en alimentos y/o en piensos es conocida desde hace muchos años.

Por ejemplo, en la patente EP 0 585 988 se reivindica que la adición de lipasa a la masa producía una mejora en el efecto antiendurecimiento. Se sugiere que una lipasa obtenida a partir de Rhizopus arrhizus cuando se añade a la masa puede mejorar la calidad del pan resultante cuando se utiliza combinada con manteca/grasa. El documento WO 94/04035 da a conocer que puede obtenerse blandura mejorada añadiendo una lipasa a la masa sin añadir grasa/aceite a la masa. Castello, P.ESEGP 89-10 Dic. 1999. Helsinki, demuestra que las lipasas exógenas pueden modificar el volumen del pan.

Las enzimas lipolíticas hidrolizan uno o más de los ácidos grasos procedentes de los lípidos presentes en el alimento lo que puede producir la formación de potentes moléculas emulsionantes en alimento lo que proporciona funcionalidad comercialmente valiosa. Las moléculas que contribuyen a las características emulsionantes más significativas son los productos de la hidrólisis parcial, tales como las moléculas de liso-fosfolípidos, lisoglucolípidos y monoglicéridos. Los productos polares de la hidrólisis de los lípidos, tales como liso-fosfolípidos y liso-glucolípidos presentan ventajas particularmente. En la elaboración del pan, dichos emulsionantes modificados in situ pueden proporcionar funcionalidad equivalente como emulsionantes, tal como DATEM.

Sin embargo, la actividad de las enzimas lipolíticas puede producir la acumulación de ácidos grasos libres que pueden conducir a funcionalidad perjudicial en el alimento. Esta actividad propia de las enzimas lipolíticas limita su funcionalidad.

Se han intentado numerosas soluciones a este problema en la técnica. Sin embargo, éstas producen un aumento significativo en los ácidos grasos libres en el alimento, particularmente alimentos con un alto contenido en agua, incluyendo, pero sin limitarse, masas de pan y yema de huevo.

Las fosfolipasas, particularmente la fosfolipasa A2 (E.C.3.1.1.4), se han utilizado durante muchos años para el tratamiento de los productos de huevo o a base de huevo (véanse por ejemplo el documento US nº

4.034.124 y Dutihl & Groger 1981 J. Sci. Food Agric. 32, 451-458). La actividad de la fosfolipasa durante el tratamiento de los productos de huevo o a base de huevo, produce la acumulación de lisolecitina polar, que puede actuar como emulsionante. El tratamiento de fosfolipasa de huevo o de productos a base de huevo puede mejorar la estabilidad, la estabilidad térmica bajo tratamiento térmico tal como la pasteurización y da como resultado sustancial engrosamiento. Los productos a base de huevo pueden incluir, pero no se limitan a pasteles, mayonesa, aliños para ensaladas, salsas, helados y similares. La utilización de fosfolipasas produce la acumulación de ácidos grasos libres. La acumulación de los ácidos grasos libres puede producir una significativa falta de sabor. Además, la acumulación de los ácidos grasos libres puede producir un aumento de sensibilidad a la oxidación, y por lo tanto producir poca estabilidad al almacenaje, decoloración del producto y alteración de otras características criticas del alimento tal como sabor y textura. Recientemente, se han comercializado enzimas lipolíticas con más amplia especificidad para el sustrato para el tratamiento de productos alimenticios como yema de huevo y afines. Éstas, tienen la ventaja de que, a diferencia de la mayoría de las fosfolipasas A2 no proceden de ningún mamífero. Sin embargo producen una significativa acumulación de los ácidos grasos libres no solamente debida a la hidrólisis de fosfolípidos sino también de triglicéridos.

Como se mencionó anteriormente, otra área donde se han utilizado extensamente las lipasas es la industria panadera. La utilización de fosfolipasas en panificación data del comienzo de 1980.

El sustrato para las lipasas en la harina de trigo es 1,5 a 3% de lípidos de trigo endógenos, que son una mezcla compleja de lípidos polares y apolares. Los lípidos polares pueden dividirse en glucolípidos y fosfolípidos. Estos lípidos están constituidos por glicerol esterificado con dos ácidos grasos y un grupo polar. El grupo polar contribuye a la actividad superficial de estos lípidos. La escisión enzimática de uno de los ácidos grasos en estos lípidos conduce a lípidos con actividad superficial mucho mayor. Es bien sabido que los emulsionantes, tal como DATEM, con gran actividad superficial son muy funcionales cuando se añaden a la masa.

Sin embargo, la utilización de las lipasas (E.C. 3.1.1.X) en productos de masa puede tener un impacto perjudicial sobre la actividad de la levadura y/o un efecto negativo sobre el volumen del pan. Un efecto negativo sobre el volumen del pan se explica con frecuencia por sobredosis. La sobredosis puede conducir a una disminución en la elasticidad del gluten que produce una masa que es demasiado rígida y por tanto produce volúmenes de pan reducidos. Además, o alternativamente las lipasas pueden degradar la manteca, el aceite o la grasa de la leche añadidos a la masa, produciendo falta de sabor en la masa y el producto horneado. La sobredosis y falta de sabor se han atribuido a la acumulación de ácidos grasos libres en la masa.

En los documentos EP 1 193 314, EP 0 977 869 y también en WO 01/39602, se publicó que la utilización de enzimas lipolíticas activas en glucolípidos era particularmente provechosa en la aplicación de la elaboración del pan ya que los productos de la hidrólisis parcial de los lisoglucolípidos se descubrió que tenían una muy alta funcionalidad de emulsionante, lo que produce aparentemente una proporción mayor de funcionalidad de emulsionante positiva en contraposición con la acumulación perjudicial de ácidos grasos libres. Sin embargo, se descubrió además que las enzimas tienen significativa actividad no selectiva sobre los triglicéridos lo que produce innecesariamente muchos ácidos grasos libres.

El mismo descubrimiento se publicó en el documento WO 00/32758, que dio a conocer variantes de la enzima lipolítica con actividad mejorada sobre fosfolípidos y/o glucolípidos, además variantes que tenían preferencia por ácidos grasos de cadena larga sobre los de corta. Esta última propiedad, dada a conocer también en el documento WO 01/39602, se estimó de particular importancia para prevenir la falta de sabores asociada a la acumulación de ácidos grasos libres de cadena corta. Sin embargo, se producen significativos ácidos grasos libres.

El problema de la alta actividad de triglicéridos se estudió en el documento WO 02/094123, en el que se da a conocer la utilización de enzimas lipolíticas activas en los lípidos polares (es decir, glucolípidos y fosfolípidos) en una masa, pero sustancialmente inactiva sobre triglicéridos o 1-monoglicéridos....

1. Procedimiento para la producción in situ de un emulsionante en un alimento que contiene agua, en el que el procedimiento comprende la etapa que consiste en añadir una lípido aciltransferasa al alimento, en el que la lípido aciltransferasa está caracterizada como una enzima que presenta actividad de aciltransferasa y que comprende el motivo GDSX de la secuencia de aminoácidos, en el que X es uno o más de los restos de aminoácidos siguientes L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que por lo menos se producen 2 emulsionantes.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la lípido aciltransferasa es una que puede transferir un grupo acilo desde un lípido a uno o más de los receptores de acilo siguientes: un esterol, un estanol, un carbohidrato, una proteína o una subunidad de la misma, glicerol.

4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que por lo menos uno de los emulsionantes es un éster de carbohidrato.

5. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que por lo menos uno de los emulsionantes es un éster de proteína.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que uno o más de entre un éster de esterol o un éster de estanol o un éster de proteína o un éster de carbohidrato o un diglicérido o un monoglicérido se produce in situ en el alimento.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el éster de esterol es uno o más de entre éster de alfa-sitosterol, éster de beta-sitosterol, éster de estigmasterol, éster de ergosterol, éster de campesterol o éster de colesterol.

8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el éster de estanol es uno o más de entre betasitostanol o ss-sitostanol.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la enzima lípido aciltransferasa comprende H-309 o comprende un resto de histidina en una posición correspondiente a His-309 en la secuencia de aminoácidos de la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila presentada como SEC. ID. nº 2 o SEC. ID. nº 32.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la lípido aciltransferasa puede obtenerse a partir de un organismo de uno o más de los géneros siguientes: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la lípido aciltransferasa comprende uno o más de las secuencias de aminoácidos siguientes: (i) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 2; (ii) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 3; (iii) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 4; (iv) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 5; (v) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 6; (vi) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 12, (vii) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 20, (viii) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 22, (ix) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 24,

(x) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 26, (xi) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 28, (xii) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 30 (véase la figura 26), (xiii) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 32, (xiv) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 34, o una secuencia de aminoácidos que presenta 75% o más de identidad con cualquiera de las secuencias presentadas como SEC. ID. nº 2, SEC. ID. nº 3, SEC. ID. nº 4, SEC. ID. nº 5, SEC. ID. nº 6, SEC. ID. nº 12, SEC. ID. nº 20, SEC. ID. nº 22, SEC. ID. nº 24, SEC. ID. nº 26, SEC. ID. nº 28, SEC. ID. nº 30, SEC. ID. nº 32 o SEC. ID. nº 34.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el que la lípido aciltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos producida por la expresión de uno o más de las secuencias nucleotídicas siguientes:

(a) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 7 (véase la figura 9);

(b) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 8 (véase la figura 10);

(c) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 9 (véase la figura 11);

(d) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 10 (véase la figura 12);

(e) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 11 (véase la figura 13);

(f) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 13 (véase la figura 15);

(g) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 21 (véase la figura 17);

(h) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 23 (véase la figura 19);

(i) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 25 (véase la figura 21);

(j) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 27 (véase la figura 23);

(k) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 29 (véase la figura 25);

(l) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 31(véase la figura 27);

(m) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 33 (véase la figura 29);

(n) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 35 (véase la figura 31);

(o) o

una secuencia nucleotídica que presenta 75% o más de identidad con cualquiera de las secuencias presentadas como SEC. ID. nº 7, SEC. ID. nº 8, SEC. ID. nº 9, SEC. ID. nº 10, SEC. ID. nº 11, SEC. ID. nº 13, SEC. ID. nº 21, SEC. ID. nº 23, SEC. ID. nº 25, SEC. ID. nº 27, SEC. ID. nº 29, SEC. ID. nº 31, SEC. ID. nº 33 o SEC. ID. nº 35.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el emulsionante es uno

o más de los siguientes: un monoglicérido, una lisofosfatidilcolina, un digalactosil monoglicérido.

14. Utilización de una lípido aciltransferasa para preparar a partir de un material alimenticio un alimento que comprende un emulsionante, en el que el emulsionante se produce sin aumentar o sin aumentar sustancialmente los ácidos grasos libres en el alimento, y en la que el emulsionante es generado por la lípido aciltransferasa a partir de los constituyentes del material alimenticio, en la que la lípido aciltransferasa está caracterizada como una enzima que presenta actividad de aciltransferasa y que comprende el motivo GDSX de la secuencia de aminoácidos, en el que X es uno o más de los restos de aminoácidos siguientes L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.

15. Utilización según la reivindicación 14, en la que por lo menos se producen dos emulsionantes.

16. Utilización según la reivindicación 15, en la que por lo menos uno de los emulsionantes es un éster de carbohidrato.

17. Utilización según la reivindicación 15, en la que por lo menos uno de los emulsionantes es un éster de proteína.

18. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15 en la que uno o más de entre un éster de esterol o un éster de estanol o un éster de proteína o un éster de carbohidrato o un diglicérido o un monoglicérido se produce asimismo in situ en el alimento.

19. Utilización según la reivindicación 18, en la que el éster de esterol es uno o más de entre éster de alfa-sitosterol, éster de beta-sitosterol, éster de estigmasterol, éster de ergosterol, éster de campesterol o éster de colesterol.

20. Utilización según la reivindicación 18, en la que el éster de esterol es uno o más de entre betasitostanol o ss-sitostanol.

21. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, en la que la enzima lípido aciltransferasa comprende H-309 o comprende un resto de histidina en una posición correspondiente a His-309 en la secuencia de aminoácidos de la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila presentada como SEC. ID. nº 2 o SEC. ID. nº 32.

22. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, en la que la lípido aciltransferasa puede obtenerse a partir de un organismo de uno o más de los géneros siguientes: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus,

Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.

23. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 22, en la que la lípido aciltransferasa comprende una o más de las secuencias de aminoácidos siguientes: (i) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 2; (ii) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 3; (iii) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 4; (iv) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 5; (v) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 6; (vi) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 12, (vii) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 20, (viii) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 22, (ix) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 24,

(x) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 26, (xi) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 28, (xii) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 30, (xiii) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 32, (xiv) la secuencia de aminoácidos presentada como SEC. ID. nº 34,

o una secuencia de aminoácidos que presenta 75% o más de identidad con cualquiera de las secuencias presentadas como SEC. ID. nº 2, SEC. ID. nº 3, SEC. ID. nº 4, SEC. ID. nº 5, SEC. ID. nº 6, SEC. ID. nº 12, SEC. ID. nº 20, SEC. ID. nº 22, SEC. ID. nº 24, SEC. ID. nº 26, SEC. ID. nº 28, SEC. ID. nº 30, SEC. ID. nº 32 o SEC. ID. nº 34.

24. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 23, en la que la lípido aciltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos producida por la expresión de una o más de las secuencias nucleotídicas siguientes:

(a) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 7 (véase la figura 9);

(b) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 8 (véase la figura 10);

(c) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 9 (véase la figura 11);

(d) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 10 (véase la figura 12);

(e) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 11 (véase la figura 13);

(f) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 13 (véase la figura 15);

(g) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 21 (véase la figura 17);

(h) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 23 (véase la figura 19);

(i) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 25 (véase la figura 21);

(j) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 27 (véase la figura 23);

(k) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 29 (véase la figura 25);

(l) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 31(véase la figura 27);

(m) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 33 (véase la figura 29);

(n) la secuencia nucleotídica presentada como SEC. ID. nº 35 (véase la figura 31);

(o) o

una secuencia nucleotídica que presenta 75% o más de identidad con cualquiera de las secuencias presentadas como SEC. ID. nº 7, SEC. ID. nº 8, SEC. ID. nº 9, SEC. ID. nº 10, SEC. ID. nº 11, SEC. ID. nº 13, SEC. ID. nº 21, SEC. ID. nº 23, SEC. ID. nº 25, SEC. ID. nº 27, SEC. ID. nº 29, SEC. ID. nº 31, SEC. ID. nº 33 o SEC. ID. nº 35.

25. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 24, en el que el emulsionante es uno o más de los siguientes: un monoglicérido, una lisofosfatidilcolina, un digalactosil monoglicérido.

26. Alimento que contiene agua que puede obtenerse por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el alimento comprende una lípido acil transferasa tal como se define en la reivindicación 1 y un emulsionante.