SECUENCIAS GENOMICAS DE CEBADORES Y SONDA PARA LA CUANTIFICACION DE ADENOVIRUS PORCINOS (PADV).

Secuencias genómicas de cebadores y sonda para la cuantificación de adenovirus porcinos (PAdV).

La invención se refiere a un test sensible para la detección de adenovirus porcinos en muestras medioambientales agua y alimentos. La invención presenta una herramienta cuantitativa para el análisis de adenovirus porcinos como indicadores de la presencia de contaminación porcina. La invención se refiere a un kit que comprende dos secuencias de cebadores y una secuencia de sonda capaces de detectar y cuantificar dicho virus por PCR. El test demostró ser de gran especificidad al no mostrar resultados positivos en muestras que contenían adenovirus humanos y bovinos. El ensayo detectó contaminación fecal porcina en muestras que estaban altamente diluidas y que habían sido recogidas a una considerable distancia de la fuente inicial

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200900596.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: BARCELONA.

Inventor/es: GIRONES LLOP,ROSA, HUNDESA GONFA,AYALKIBET, MALUQUER DE MOTES PORTA,CARLOS.

Fecha de Solicitud: 25 de Febrero de 2009.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 17 de Junio de 2011.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/09 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12Q1/68D4
  • C12Q1/68M10B

Clasificación PCT:

  • C12N15/09 C12N 15/00 […] › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2344443_A1.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Secuencias genómicas de cebadores y sonda para la cuantificación de adenovirus porcinos (PAdV).

Campo de la invención

La invención describe un método para la detección de PAdV en muestras medioambientales, agua y alimentos.

Estado de la técnica anterior

La contaminación microbiológica del medio ambiente supone un riesgo significativo para la salud humana a través de exposiciones recreacionales o consumo de agua o alimentos contaminados. De acuerdo con los requerimientos de la Directiva Marco para el Agua y la Ley para Aguas Limpias de los Estados Unidos de América, ha existido un cambio en las normativas sobre la calidad de los efluentes desde el enfoque tradicional sobre una fuente puntual hacia un enfoque de captura más amplio (cfr. Stapletone et al., "Microbial Source tracking: a forensic technique for microbial source identification" J. Environ. Monit. 2007, vol. 9, pp. 427-39). Dado este nuevo enfoque, existe la necesidad de nueva información en las dinámicas microbianas de las áreas de captación de aguas para un control efectivo de la calidad de las aguas en el punto de uso. Históricamente, se han usado indicadores bacterianos incluyendo Escherichia coli y bacterias coliformes fecales para monitorear la calidad y seguridad de las aguas. Sin embargo, estas monitorizaciones no están a menudo correlacionadas con patógenos virales o parásitos protozoos y por lo tanto dejan sin resolver el problema de la detección en tiempo real.

La contaminación fecal se puede originar desde fuentes puntuales o no puntuales. Generalmente, las fuentes puntuales de contaminación fecal incluyen fuentes discretas como vertidos procedentes de grandes operaciones de cría de animales, efluentes tratados y no tratados de aguas residuales, agua de tormentas, y alcantarillado combinado. Las fuentes no puntuales son difusas e incluyen fuentes agrícolas y residuos animales aplicados a los campos agrícolas. La identificación de las fuentes de contaminación microbiológica juega un papel muy importante en la obtención de estrategias de manipulación y remediación efectivas, y se conoce como trazabilidad de fuentes de contaminación microbianas ("microbial source tracking", MST). MST incluye un grupo de metodologías que tienen el fin de identificar, y en algunos casos cuantificar, las fuentes dominantes de contaminación fecal en el ambiente y, más específicamente, en recursos hídricos (cfr. Stoeckel et al. "Performance, Design, and Analysis in Microbial Source Tracking Studies" Appl. Environ. Microbiol. 2007, vol. 73, pp. 2405-15). La contaminación medioambiental y de las aguas por residuos generados en granjas porcinas es una fuente de contaminación química y microbiológica. El virus de la hepatitis E es un patógeno viral humano que causa hepatitis aguda y se ha descrito como altamente prevalente en cerdos jóvenes y frecuentemente presente en muestras fecales, así como en aguas residuales y lodos producidos en mataderos que procesan cerdos (cfr. Clemente-Casares et al., "Hepatitis E virus epidemiology in industrialised countries" Emerging Infectious Diseases 2003, vol. 9, pp. 448-54). El problema remanente es la identificación positiva de contaminación fecal de origen porcino, que permita localizar con exactitud la fuente de contaminación para procesos de remediación y evaluar el impacto potencial sobre la salud pública de la contaminación fecal en el agua.

Se han descrito varios métodos moleculares basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección específica de virus como adenovirus humanos (HAdV) y poliomavirus (JCPyV y BKPyV), adenovirus porcinos (PAdV) y poliomavirus bovinos (BPyV) como indicadores de contaminación de origen animal o humano en aguas y en moluscos bivalvos (cfr. Bofill-Mas et al., "Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices" Appl. Environ. Microbiol. 2006, vol. 72, pp. 7894-6; Formiga-Cruz et al., "Evaluation of potential indicators of viral contamination in shellfish with applicability to diverse geographical areas" Appl. Environ. Microbiol. 2003, vol. 69, pp. 1556-63; Hundesa et al., "Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment" Appl. Environ. Microbiol. 2006. vol. 72, pp. 7886-93; Pina et al., "Viral pollution in the environment and shellfish: human adenovirus detection by PCR as an index of human viruses" Appl. Environ. Microbiol. 1998, vol. 64, pp. 3376-82; Puig et al., "Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested-PCR amplification" Appl. Environ. Microbiol. 1994, vol. 60, pp. 2963-70; Maluquer et al. "Detection of Bovine and Porcine Adenoviruses for Tracing the Source of Fecal Contamination" Appl. Environ. Microbiol. 2004, vol. 70, pp. 1448-54).

Otros estudios se relacionan con métodos similares para enterovirus bovinos y tescovirus (cfr. Jiménez-Clavero et al., "Teschoviruses as indicators of porcine fecal contamination of surface water" Appl. Environ. Microbiol. 2003. vol. 69, pp. 6311-5; and "Survey of bovine enterovirus in biological and environmental samples by a highly sensitive real-time reverse transcription-PCR" Appl. Environ. Microbiol. 2005, vol. 71, pp. 3536-43).

La elevada estabilidad de los virus en el medio ambiente, la especificidad de huésped y la elevada prevalencia de algunas infecciones víricas a lo largo del año en la población apoya considerablemente el uso de técnicas de PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR) para la identificación y cuantificación de virus específicos que pueden ser usados como herramientas de trazabilidad de la fuente de contaminación. Para la identificación de contaminación fecal de origen porcino, la cuantificación de virus de DNA excretados persistentemente a lo largo del año puede permitir el desarrollo de protocolos de coste efectivo con cuantificaciones de mayor exactitud de las fuentes de contaminación en comparación con virus de RNA; esto se debe a la mayor exactitud de la cuantificación por qPCR y a la menor sensibilidad a inhibidores, puesto que la transcriptasa reversa no es usada cuando se amplifican virus DNA.

Los protocolos de PCR y PCR anidada (nPCR) se usan típicamente debido a su elevada sensibilidad, pero no son cuantitativos y están sujetos a una alta probabilidad de contaminación cruzada por DNA, que normalmente se soluciona mediante secuenciación de los productos de PCR. La qPCR a tiempo real ha emergido como una técnica valiosa porque reduce exitosamente las probabilidades de contaminación en el laboratorio y las manipulaciones que consumen tiempo, y permite la cuantificación rápida y sensible de pequeñas cantidades de DNA diana en muestras biológicas y medioambientales.

La familia Adenoviridae es el único grupo conocido de virus entéricos que presenta genomas DNA de doble cadena. Esto representa una ventaja debido a la conservación y estabilidad de las secuencias. La familia Polyomaviridae incluye también virus DNA que producen infecciones persistentes y que son frecuentemente excretados en la orina, y por estos motivos ambos virus han sido propuestos como marcadores de la contaminación fecal. Los adenovirus humanos (HAdVs) son altamente prevalentes en aguas residuales así como en agua de río y moluscos bivalvos con contaminación fecal (cfr. Fong et al., "Enteric viruses of humans and animals in aquatic environments: health risks, detection, and potential water quality assessment tools" Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2005, vol. 69, pp. 357-71; and "Molecular assays for targeting Human and Bovine viruses in coastal water and their application for Library-lndependent source tracking" Appl. Environ. Microbiol. 2005, vol. 71, pp. 2070-8) y están distribuidos de forma conservada en diversas áreas geográficas. Además, los adenovirus son más estables que los enterovirus a la radiación UV y a la fluoración. Como un grupo específico dentro de la familia, los adenovirus porcinos (PAdV) pertenecen al género Mastadenovirus. están divididos en seis serotipos y se han descrito como abundantes y altamente prevalentes en heces, aguas residuales de matadero y lodos (cfr. Hundesa et al., "Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment" Appl. Environ. Microbiol. 2006, vol. 72, pp. 7886-93). Otra ventaja de los PAdV es que están ampliamente diseminados en la población porcina y no producen enfermedades severas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para la detección y/o cuantificación de adenovirus porcinos (PAdV) en una muestra, dicho método comprendiendo:

a) la extracción del ácido nucleico de PAdV de la muestra;

b) la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa del ácido nucleico extraído en presencia de al menos un cebador seleccionado entre SEQ ID NO: 1 o una variante funcional del mismo, SEQ ID NO: 2 o una variante funcional del mismo, y SEQ ID NO: 3 o una variante funcional del mismo, o sus cadenas complementarias; y

c) la detección y/o cuantificación de PAdV evaluando el resultado de la reacción en cadena de la polimerasa.

2. Método según la reivindicación 1, donde la reacción en cadena de la polimerasa es una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR).

3. Método según la reivindicación 2, donde la qPCR es en presencia de una sonda específica para la secuencia del genoma de PAdV.

4. Método según la reivindicación 3, donde la sonda comprende la secuencia identificada como SEQ ID NO: 3 o una variante funcional de la misma, o su secuencia complementaria.

5. Método según la reivindicación 4, donde la SEQ ID NO: 3 o su cadena complementaria lleva un grupo fluoróforo y un agente bloqueador.

6. Método según la reivindicación 1, donde la evaluación comprende una comparación de la cuantificación del resultado de la reacción en cadena de polimerasa con al menos una muestra control.

7. Método según la reivindicación 6, donde la muestra control comprende un control positivo tomado de al menos una curva estándar generada por una reacción en cadena de la polimerasa en presencia de los cebadores correspondientes a SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o sus secuencias complementarias, en una secuencia de 612 pb del gen del hexon de PAdV-3 a diferentes concentraciones.

8. Método según la reivindicación 1, donde la reacción en cadena de la polimerasa es una reacción en cadena de la polimerasa semi-anidada en presencia de uno de los cebadores identificados como SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una variante funcional de los mismos, y de la secuencia SEQ ID NO: 3 o una variante funcional de la misma, o sus secuencias complementarias.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la muestra es una muestra medioambiental.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la muestra es una muestra de agua.

11. Método según la reivindicación 10, donde la muestra es una muestra de agua residual.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la muestra es una muestra de residuos de matadero.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la muestra es una muestra de alimentos.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la muestra una muestra de fertilizante.

15. Oligonucleótidos identificados por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, y sus secuencias complementarias.

16. Uso de los oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o sus secuencias complementarias como cebadores específicos para el genoma de PAdV, y del oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 3 o su secuencia complementaria como sonda específica para la secuencia del genoma de PAdV.

17. Uso de los cebadores y la sonda según la reivindicación 16, o una variante funcional de los mismos, para la detección de PAdV usando la reacción en cadena de la polimerasa.

18. Kit para la realización del método definido en la reivindicación 1, que comprende al menos uno de los cebadores identificados como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y/o la sonda identificada como SEQ ID NO: 3, o sus secuencias complementarias.


 

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