Polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en: - un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID n.

º 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con ésta; - un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp .depositada con el número de acceso NCIMB 41248; - un polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp.depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80%con ésta;y - un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp.depositada con el número de acceso NCIMB 41248 y en el que el péptido se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp.depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con ésta, en donde dicho polipéptido tiene actividad fitásica,en donde dicho polipéptido tiene una actividad específica de al menos 300 U/mg,en donde dicha actividad específica se determina por la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM,CaCl2 a 0,8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a pH 3,5,a una temperatura de 37 ºC

La presente invención se refiere a fitasas, secuencias nucleotídicas para las mismas, métodos de producción de las fitasas y sus usos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al ámbito de las enzimas para aditivos para productos alimentarios para consumo animal. Más específicamente, la presente invención se refiere a fitasas que se pueden utilizar para mejorar la digestión del fosfato en los alimentos y los piensos para consumo animal.

ANTECEDENTES TÉCNICOS Y TÉCNICA PREVIA

El fitato es la principal forma de almacenamiento del fósforo en los cereales y las legumbres. No obstante, los animales monogástricos, tales como el cerdo, las aves de corral y los peces, no son capaces de metabolizar ni de absorber el fitato (o ácido fítico) y, por lo tanto, se excreta, lo que conduce a la contaminación con fósforo en zonas de cría intensiva de ganado. Además, el ácido fítico también actúa como un agente antinutricional en los animales monogástricos al atrapar metales, tales como el calcio, el cobre y el zinc.

Para proporcionar suficientes fosfatos para el crecimiento y la salud de estos animales, se añade fosfato inorgánico a su dieta. Tal adición puede ser costosa y además aumenta los problemas de contaminación.

Mediante la acción de la fitasa, el fitato se hidroliza por lo general para dar inositol-fosfatos inferiores y fosfato inorgánico. Las fitasas son útiles como aditivos de las comidas para animales, en las que mejoran la disponibilidad del fósforo orgánico para el animal y disminuyen la contaminación del medio ambiente con fosfato [Wodzinski R. J., Ullah A.

H. Adv. Appl. Microbiol. 42, 263-302 (1996)].

Se han descrito en la bibliografía una serie de fitasas de origen fúngico [Wyss M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 367-373 (1999); Berka R. M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 64 (11), 4423-4427 (1998); Lassen S. et al. Appl. Environ. Microbiol. 67 (10), 4701-4707 (2001)] y bacteriano [Greiner R. et al. Arch. Biochem. Biophys. 303 (1), 107-113 (1993); Kerovuo et al. Appl. Environ. Microbiol. 64 (6), 2079-2085 (1998); Kim H. W et al. Biotechnol. Lett. 25, 1231-1234 (2003); Greiner R. et al. Arch. Biochem. Biophys. 341 (2), 201-206 (1997); Yoon S. J. et al. Enzyme and Microbial Technol. 18, 449-454 (1996); Zinin N. V. et al. FEMS Microbiol. Lett., 236, 283-290 (2004)].

Sin embargo, hasta la fecha, ninguna de esta fitasas muestra las propiedades requeridas para el uso eficaz como un complemento del pienso para consumo animal. En particular, las fitasas fúngicas tienden a ser proteolíticamente inestables [Igbasan F. A. et al. Arch. Anim. Nutr. 53, 353-373 (2000)] y, por lo tanto, susceptibles a la degradación, mientras que la mayor parte de las fitasas bacterianas tienen una especificidad de sustrato muy restringida solo al fitato y degradan mal los inositol-fosfatos con grados de fosforilación intermedios [Greiner R. et al., Arch. Biochem. Biophys. 303 (1), 107-113 (1993); Kerovuo J. et al. Biochem. J. 352, 626-628 (2000)].

UNIPROT: Q6U677. El n.º de acceso de la base de datos Q6U677 de 5 julio de 2004 se refiere a la fitasa XP002391879.

La patente internacional WO2004/015084 se refiere a las enzimas mutantes de la fitasa appA de E. coli y a las variantes naturales de la misma, a los ácidos nucleicos que codifican tales enzimas fitásicas, a los vectores ycélulas hospedadoras que las llevan incorporadas, y a los métodos para fabricarlas y usarlas.

La patente internacional WO 2004/085638 se refiere a la fitasa producida por Citrobacter braakii.

El n.º de acceso PREV200300308051 de Zinin N. V. et al. de la base de datos se refiere a la actividad fitásica de varios grupos de bacterias.

Vats Purva et al. se refiere a estudios de producción y propiedades catalíticas de las fitasas (mioinositolhexakisfosfato fosfohidrolasas): una perspectiva general.

Por consiguiente, se necesitan fitasas mejores.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En un aspecto amplio, la presente descripción se refiere a las fitasas procedentes de una bacteria y a formas modificadas de las mismas. En particular, la descripción se refiere a las fitasas procedentes de la bacteria Buttiauxella sp. y a las variantes/formas modificadas de las mismas seleccionadas y/o modificadas genéticamente para mejorar las características en comparación con la enzima de tipo salvaje (enzima madre).

La presente descripción resulta ventajosa ya que da a conocer fitasas nuevas que tienen propiedades que las hacen particularmente útiles y eficaces como enzimas para piensos. En particular, la descripción se refiere a polipéptidos de fitasas nuevas purificadas y/o aisladas tal y como se describe en la presente memoria, o un fragmento funcional, o variantes o formas modificadas de la misma, o una forma modificada de la misma. La descripción también da a conocer la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha fitasa.

Para ser eficaz como un aditivo enzimático para alimentos o para piensos para consumo animal, la fitasa tiene que reunir una serie de propiedades diferentes. Para poder degradar el ácido fítico en el medio ácido del estómago de un animal, tiene que ser activa a pH bajo, preferentemente a lo largo un intervalo amplio de valores de pH. Además, tiene que tener una actividad específica elevada y preferentemente una termoestabilidad elevada para permitir que la proteína aguante las temperaturas elevadas que con frecuencia se utilizan para la preparación productos alimentarios para consumo animal tales como los piensos granulados.

También es importante que la enzima tenga una amplia especificidad de sustrato que le permita hidrolizar no sólo el fitato, sino también los productos intermedios de la degradación del fitato, tal como los inositol-pentafosfatos, tetrafosfatos y -trifosfatos. Los estudios sobre la degradación del fitato en los cerdos demuestran que estos inositololigofosfatos permanecerían, si no, muy insolubles en el intestino delgado y en el intestino grueso y, por lo tanto, inaccesibles para las fosfatasas alcalinas producidas por el animal y la microflora intestinal [Schlemmer U. et al., Arch, Anim. Nutr. 55, 255-280 (2001)]. Se han identificado variaciones en el perfil de especificidad del sustrato de diferentes enzimas. Por ejemplo, los inositol-trifosfatos generados por la fitasas de B. subtilis son esencialmente resistentes a la hidrólisis adicional por esta enzima [Kerovuo J. et al. Biochem. J. 352, 623-628 (2000)].

En otro aspecto de la descripción, se da a conocer un plásmido o sistema de vector, o un organismo transformado o transgénico que comprende una nueva fitasa como la descrita en la presente memoria o una forma modificada de la misma.

En otro aspecto, la presente descripción se refiere a organismos transgénicos modificados para que expresen una nueva fitasa como la descrita en la presente memoria o una forma modificada de la misma, y por lo tanto son capaces de producir una fitasa. La presente descripción da a conocer más medios y métodos para la producción biotecnológica de las fitasas y su uso como complementos para los piensos.

En las reivindicaciones se presentan los aspectos de la presente invención y se explican en el comentario siguiente.

Para facilitar la consulta, éstos y otros aspectos de la presente descripción se explican ahora en los encabezados de apartados adecuados. No obstante, las enseñanzas que contiene cada apartado no se limitan necesariamente a cada apartado particular.

Tal y como se utiliza con referencia a la presente invención, la terminología «producir», «que produce», «producido», «producible» y «producción» son sinónimos de los términos correspondientes «preparar», «que prepara», «preparado», «preparación», «generado», «generación» y «preparable».

Tal y como se utiliza con referencia a la presente invención, la terminología «expresión», «expresa», «expresado» y «expresable» son sinónimos de los términos correspondientes «transcripción», «transcribe», «transcrito» y «transcribible».

Tal y como se utiliza con referencia a la presente invención, la terminología «transformación» y «transfección» se refieren a un método para introducir secuencias de ácido nucleico en hospedadores, células hospedadoras, tejidos u órganos.

Otros aspectos que se refieren a secuencias nucleotídicas que se pueden utilizar en la presente invención incluyen:... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en:

• un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID n.º 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con ésta;

• un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248;

• un polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con ésta; y

• un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 y en el que el péptido se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con ésta,

en donde dicho polipéptido tiene actividad fitásica, en donde dicho polipéptido tiene una actividad específica de al menos 300 U/mg, en donde dicha actividad específica se determina por la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0,8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a pH 3,5, a una temperatura de 37 ºC.

2. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido está aislado y/o purificado.

3. Polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que dicho polipéptido tiene una actividad máxima en torno a pH 3 a 6, en donde dicha actividad se determina por la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0,8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a una temperatura de 37 ºC.

4. Polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que dicho polipéptido tiene una actividad máxima en torno a pH 4 a 5, en donde dicha actividad se determina por la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0,8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a una temperatura de 37 ºC.

5. Polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que dicho polipéptido tiene una actividad máxima en torno a pH 4,5, en donde dicha actividad se determina por la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0,8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a una temperatura de 37 ºC.

6. Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende mutaciones en al menos una de las posiciones siguientes, numeradas según la numeración de la SEQ ID n.º 3: K 59, T 70, A 122, D 125, T 167, H 193, F 197, T 204, T 209, A 211, S 221, I 223, S 225, K 240, A 242, D 244, A 268, S 281, Q 289, A 294, N 303, I 336 o N

351.

7. Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho polipéptido comprende una o más de las siguientes mutaciones:

K 59 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y;

o

T 70 A, C, D, E, F, G, H, I, K,L, M, N, P, Q,R, S, V, W, o Y;

o

A 122 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y;

o

D 125 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y;

o

T 167 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, o Y;

o

H 193 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o F 197 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o T 204 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, o Y; o T 209 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, o Y; o A 211 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o S 221 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o D 223 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o G 225, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, o Y; o K 240 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o A 242 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o D 244 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o A 268 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o S 281 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o Q 289 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, o Y; o A 294 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o N 303 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o I 336 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o N 351 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y.

8. Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende al menos una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en: K59E; T167V; K240T; T167I; K240E; D244C; Q289Y; T209K o F197S.

9. Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende una combinación de mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en: D125E/H193R; o A294E/N303K; o T167I/K240T; o D223E/K240E/N351D; o T167I/K240T/A294E/N303K; o T167I/K240E/A242S/A294E/N303K; o A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K; o A 22T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K; o A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A2944E/N303K; o D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q2891H/A294E/N303K; o

A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F; o N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K.

10. Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende la combinación de mutaciones:

A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K.

11. Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en donde dicho polipéptido aislado es una variante de la enzima fitasa que tiene una termoestabilidad mayor y/o una actividad específica mayor y/o una estabilidad proteolítica mayor que la enzima fitasa codificada por la SEQ ID n.º 2.

12. Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 85% con la SEQ ID n.º 3.

13. Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 90% con la SEQ ID n.º 3.

14. Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 95% con la SEQ ID n.º 3.

15. Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 96% con la SEQ ID n.º 3.

16. Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 97% con la SEQ ID n.º 3.

17. Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 98% con la SEQ ID n.º 3.

18. Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 99% con la SEQ ID n.º 3.