IDENTIFICACIÓN DE PATÓGENOS.

La presente invención se refiere a la identificación de patógenos en infecciones de fluidos corporales A pesar de los progresos continuados en el diagnóstico y la terapia precoz de las infecciones que se transmiten por la sangre, las tasas de mortalidad siguen siendo elevadas. Los procedimientos tradicionales para la identificación de microorganismos están basados en procedimientos de hemocultivo que requieren el cultivo microbiano con la posterior caracterización morfológica y fisiológica (Peters y col., 2004). Diferentes científicos y algunos programas de investigación clínica han controlado periódicamente la frecuencia de la incidencia de patógenos humanos. Se ha demostrado que más del 95% de todas las infecciones que se transmiten a través del torrente sanguíneo están producidas únicamente por 15 géneros diferentes. Staphylococcus sp. y Escherichia sp. representan más del 50% de las infecciones. Los estudios de diversidad variaron solo ligeramente entre diferentes países y laboratorios. Aunque las tasas globales de infección por patógenos son estables en el tiempo, especialmente las infecciones por Pseudomonas aeruginosa están claramente en aumento, representando el único patógeno asociado con tasas de mortalidad crecientes (Fluit y col 2001; Kempf y col., 2000; Shigei y col., 1995; Meremikwu y col., 2005; Vincent y col., 2006). Los primeros procedimientos para la determinación de la cantidad bacteriana en las infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo se basaban en la diseminación de sangre completa en un medio de cultivo sólido, incubación, y posterior evaluación mediante recuento de las unidades formadoras de colonias (UFC). Los cultivos aislados de pacientes con infecciones estafilocócicas y estreptocócicas contenían hasta 100 UFC por ml de sangre, mientras que se han contado bacterias E. coli en exceso 1000 UFC/ml Se han encontrado cantidades similares de otras bacterias gram negativas (Yagupsky y col., 1990; Henry y col., 1983). Recientes publicaciones basadas en técnicas moleculares han propuesto que el recuento bacteriano pueda ser mayor que el inicialmente supuesto. Se ha usado la RT-PCR cuantitativa para definir principalmente curvas patrón de cantidades bacterianas en sangre completa para una posterior determinación de cargas bacterianas en muestras clínicas. Se han encontrado densidades en sangre que varían de 10 4 a 5,4 x 10 5 bacterias por ml de Streptococcus pneumoniae. Se han detectado otros microorganismos gram positivos o negativos en una extensión de 10 4 a 10 7 por ml en pacientes de bacteremia. Hackett incluso ha demostrado una concentración punta en casos graves de septicemia hasta un máximo de 1,8 x 10 9 bacterias por ml (Hackett y col., 2002; van Haeften y col., 2003; Massi y col., 2005,). Una explicación de la discrepancia entre el cultivo y los procedimientos moleculares es la incapacidad de algunos microorganismos de multiplicarse en condiciones de cultivo normalizadas (Keer y Birch, 2003). Además, los procedimientos basados en la detección del ADN incluyen también el genoma no digerido de bacterias muertas o estáticas (Nogva y col., 2000; Nikkari y col., 2001). Los sistemas automatizados de hemocultivos tales como BacT/Alert y Bac-TEC9240 son las técnicas de cultivo normalizadas en la práctica clínica moderna. Algunas investigaciones han demostrado que se producen periódicamente resultados falsos negativos debido a condiciones de crecimiento inapropiadas. Se han tratado adicionalmente hemocultivos sin crecimiento microbiano detectable y se han obtenido posteriormente resultados positivos en del 3 al 40% de los casos dependiendo del procedimiento de detección (Shigei y col., 1995; Kocoglu y col., 2005; Karahan y col., 2006). Heininger y col. (1999) han demostrado la ventaja de la detección mediante la PCR del tratamiento con antibióticos anterior en un modelo de rata. La tasa de detección de los hemocultivos clásicos ha caído hasta el 10% en 25 min tras la administración intravenosa de cefotaxima mientras que el índice de detección de la PCR era del 100% en ese momento. Se llevó a cabo de manera rutinaria el cultivo de levaduras en frascos de cultivo. Los sistemas ofrecidos funcionan a una sensibilidad del 100% cuando se usan para la detección de infecciones de Candida (Horvath y col., 2004). Los procedimientos diagnósticos convencionales tardan al menos 24 horas debido a su requerimiento de crecimiento microbiano En general la detección e identificación en un proceso muy largo que varía normalmente de 2 a 5 días para la mayor parte de organismos o incluso más para organismos exigentes (Marlowe y col., 2003; Reimer y col., 1997; Henry y col., 1983). En contraste con esto, los procedimientos basados en el ADN cumplen la necesidad de un diagnóstico rápido, fiable y por tanto, protector de la vida (Belgrader y col., 1999; Vincent y Abraham 2006). Sin embargo, estos procedimientos no han sido capaces de adaptarse a las necesidades de la especificidad para el presente campo del hemodiagnóstico. Rivers y col. (2005) destacaron la importancia del tratamiento temprano en las seis horas desde los primeros síntomas de bacteremia en una unidad de cuidados intensivos (UCI), antes, de esta manera, de la transición desde sepsia a la sepsia grave. Se espera que los ensayos moleculares sustituyan las técnicas microbiológicas convencionales para la 2 E07784579 21-10-2011   detección de las enfermedades del torrente sanguíneo. Los procedimientos basados en la amplificación de la PCR y la posterior hibridación de sondas fluorescentes parecen ser los enfoques más prometedores (Peters y col., 2004). Se han adaptado diferentes procedimientos moleculares, que incluyen la utilización de sondas marcadas fluorescentemente, para la detección de patógenos clínicos. La hibridación fluorescente in situ (FISH), la PCR, la PCR en tiempo real el polimorfismo de conformación monocatenaria de la PCR basado en fluorescencia (SSCP), y se han empleado micromatrices de oligonucleótidos para la identificación de microorganismos de pacientes con bacteremia, incluyéndose todavía sin embargo una etapa de enriquecimiento bacteriano basada en cultivo (Kempf V.A.J. y col., (2000); Peters y col., 2006; Mothershed E.A. y Whitney A.M. (2006); Rantakokko-Jalava (2000); Turenne C.Y. y col., (2000); Aoki S. y col., (2003); Martineau F. y col., (2001); Yadaf A.K. y col., (2005); Lehner A. y col., (2005); Shang S., y col., (2005)). Se ha descrito la tecnología de micromatrices como una poderosa herramienta en diversas aplicaciones clínicas tales como la identificación de patógenos de las infecciones del tracto urinario (ITU), las infecciones agudas del tracto respiratorio superior, los patógenos periodontales y las bacterias intestinales humanas. Las micromatrices se aplican además para el análisis de la expresión génica y la diversidad microbiana (Bryant y col., 2004; Kato-Maeda y col., 2001; Wang y col., 2002; Roth y col., 2004; Yu y col., 2004). El documento WO2001/07648 A1 describe un procedimiento para la identificación con un procedimiento de amplificación tal como la PCR. Se pueden clasificar los microorganismos por las longitudes del amplificado. El documento US 2004/0023209 A1 describe una reacción de extensión del cebador para visualizar las secuencias de microorganismos para su identificación. Se puede usar el ARNr de 16S y 18S como sondas. De acuerdo con el documento DE 197 13 556 A1, se pueden identificar los microorganismos mediante la distribución de oligonucleótidos cortos. Modelos específicos de distribución pueden estar asociados a algunos microorganismos de tipo E. coli, B. subtilis y H. influenzae. Liu y col. (Experimental Biology and Medicine, 230 (8) (2005): 587-591) describen una micromatriz con sondas específicas de ARNr de 16S para la identificación de microorganismo en el CSF. Las sondas de oligonucleótidos descritas la anterior deben hibridarse solo con una especie bacteriana con la hibridación no específica minimizada. Keramas y col. (Molecular and cellular Probes, 17 (4) (2003): 187-196) describen una micromatriz de ADN para la identificación de Campylobacter y otras bacterias de referencia tales como Arcobacter, Helicobacter y E. coli. El material de muestra usado en la anterior fue materia fecal de pollo que puede contener sangre en el caso de una infección por Campylobacter. En resumen, los procedimientos de identificación tradicionales de microorganismos en la vida clínica cotidiana se basan normalmente en el cultivo que necesita tiempo para llevarse a cabo, con la posterior caracterización morfológica y fisiológica. Los procedimientos de hemocultivo son la regla de oro en el diagnóstico de infecciones microbianas transmitidas a través de la sangre. Sin embargo, la identificación precoz de la infección que producen los microbios es el requisito crucial para un rápido y óptimo... [Seguir leyendo]

1.- Procedimiento de identificación de patógenos microbianos, preferiblemente patógenos humanos, en una muestra de fluido corporal, que comprende a) proporcionar una muestra de fluido corporal, b) lisar los patógenos microbianos y llevar a cabo una reacción de amplificación del ácido nucleico, preferiblemente la PCR, sobre el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S en el que o a partir de la cual los ácidos amplificados se marcan, c) poner en contacto los ácidos nucleicos amplificados marcados de la etapa b) con una micromatriz que comprende en zonas definidas en la superficie de la micromatriz sondas multiespecíficas inmovilizadas de ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S de los patógenos microbianos, d) detectar la unión de una o más especies de los ácidos nucleicos amplificados marcados con una sonda detectando un ácido nucleico amplificado marcado que se está uniendo específicamente a la micromatriz, y e) identificar un patógeno microbiano en la muestra de fluido corporal correlacionando la unión detectada de los ácidos nucleicos amplificados marcados con las zonas definidas de las sondas multiespecíficas inmovilizadas del ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S de los patógenos microbianos, lo que comprende usar la información de la unión de los ácidos nucleicos marcados con sondas multiespecíficas inmovilizadas sobre la superficie de la micromatriz usando los modelos de hibridación previstos con no correspondencias ponderadas. 2.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la reacción de amplificación del ácido nucleico sobre el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S se lleva a cabo con cebadores universales para el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S, preferiblemente con no más de ocho cebadores, de manera más preferida con no más de seis cebadores, preferiblemente con no más de cuatro cebadores, de manera particularmente preferida con los cebadores de acuerdo con las Seq. ID Nos. 1, 2, 4 y 5, preferiblemente con la ADN polimerasa GoTaq ® o FirePol ® . 3.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque entre la etapa a) y la etapa b) se lleva a cabo una etapa de filtración, en la que la muestra se filtra a través de un filtro que contiene leucocitos presentes en dicha muestra de fluido corporal, preferiblemente una muestra de sangre, pero que no contiene los patógenos microbianos. 4.- Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el marcado de los ácidos nucleicos se lleva a cabo mediante la extensión del cebador, transcripción in vitro, marcado con biotinaestreptavidina, marcado basado en el fragmento Klenow isotérmico, o marcado directo mediante amplificación del ácido nucleico, preferiblemente mediante marcado directo mediante la PCR. 5.- Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los ácidos nucleicos amplificados marcados se aplican directamente a la micromatriz sin una purificación o etapa de lavado tras la reacción de amplificación del ácido nucleico. 6.- Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la micromatriz comprende sondas inmovilizadas de ADN microbiano que codifican el ARNr de 16S o 18S, de al menos diez, preferiblemente al menos 15, especialmente al menos 20, de los siguientes patógenos microbianos: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca , Citrobacter koseri, Citrobacter freundii, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Serratia marcescens, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter radioresistens, Acinetobacter johnsonii, Candida albicans, Candida parapsilosis, que comprende preferiblemente sondas para al menos una cepa de al menos 10 especies diferentes, preferiblemente de al menos 15 especies diferentes, especialmente de al menos 20 especies diferentes, de las siguientes especies: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Citrobacter koseri, Citrobacter freundii, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis , Proteus vulgaris, Serratia marcescens, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter radioresistens, Acinetobacter johnsonii, Candida albicans, Candida parapsilosis. 7.- Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la micromatriz comprende al menos 10, preferiblemente 20, de manera más preferida al menos 30, especialmente al menos 40, E07784579 21-10-2011   sondas inmovilizadas multiespecíficas, y/o al menos un 20%, preferiblemente al menos un 40%, especialmente al menos un 50%, de las sondas inmovilizadas en la micromatriz son sondas multiespecíficas. 8.- Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la micromatriz comprende al menos 5, preferiblemente al menos 10, de manera más preferida al menos 20, de manera incluso más preferida al menos 30, especialmente al menos 50, de las sondas de acuerdo con las Seq. ID Nos 6 a 80. 9.- Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque las sondas en la micromatriz se seleccionan para representar al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, de manera más preferida al menos el 95%, especialmente al menos el 98%, de los patógenos microbianos, especialmente bacterianos, conectados con o sospechosos de estar relacionados con sepsia. 10.- Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el patógeno microbiano es de infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo y la muestra de fluido corporal es una muestra de fluido vaginal, preferiblemente, en el que la matriz comprende al menos 5, preferiblemente al menos 10, de manera más preferida al menos 20, incluso de manera más preferida al menos 30, especialmente al menos 50, de las sondas de acuerdo con las Seq. ID Nos 81 a 138. 11.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque la micromatriz comprende sondas inmovilizadas de ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S de al menos una, preferiblemente al menos 2, especialmente al menos 3, de los siguientes patógenos microbianos: Gardnerella vaginalis, Atopobium, Mobiluncus y Bacteroides. 12.- Procedimiento para la identificación de patógenos microbianos en una muestra de fluido corporal que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una muestra de fluido corporal sospechosa de contener dichos patógenos microbianos, b) lisar los patógenos microbianos y llevar a cabo una reacción de amplificación del ácido nucleico en el ADN que codifica el ARNr de 16S o 18S, c) poner en contacto los ácidos nucleicos amplificados de la etapa b) con una micromatriz que comprende en zonas definidas en la superficie de la micromatriz sondas multiespecíficas inmovilizadas para el ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S procedente de patógenos microbianos, d) detectar la unión de una o más especies de los ácidos nucleicos amplificados con una sonda detectando un ácido nucleico amplificado que se está uniendo específicamente a la micromatriz mediante un dispositivo de la micromatriz que detecta el episodio de unión de un ácido nucleico amplificado con una sonda inmovilizada, y e) identificar un patógeno microbiano en la muestra de fluido corporal correlacionando la unión detectada de los ácidos nucleicos amplificados con zonas definidas de las sondas inmovilizadas multiespecíficas del ADM microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S procedente de patógenos microbianos, usando la información de la unión de los ácidos nucleicos amplificados con sondas multiespecíficas inmovilizadas en la superficie de la micromatriz usando los modelos de hibridación previstos cono no correspondencias ponderadas. en el que se aplican preferiblemente las formas de realización específicas que se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, excepto que en vez de los ácidos nucleicos amplificados marcados se aplican ácidos nucleicos no marcados. 13.- Kit que comprende una micromatriz tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6 a 12 y un producto de programa informático para identificar un patógeno microbiano correlacionando la unión detectada de los ácidos nucleicos marcados o amplificados con zonas definidas de sondas multiespecíficas unidas del ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S procedente de patógenos microbianos en la micromatriz que usa la información de la unión de los ácidos nucleicos marcados o amplificados con sondas multiespecíficas inmovilizadas en la superficie de la micromatriz usando modelos de hibridación previstos con no correspondencias ponderadas. 14.- Kit de ensayo que comprende un elemento que retiene una muestra para una muestra de sangre, un kit de acuerdo con la reivindicación 13 y opcionalmente los cebadores que se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, siendo los cebadores preferiblemente específicos para la amplificación del ADN microbiano que codifica el ARNr de 16S o 18S de los patógenos, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 6, 10 u 11, y opcionalmente un filtro adecuado que contiene leucocitos pero que no contiene patógenos microbianos. 15.- Uso de una micromatriz, tal como se define en la reivindicación 13 o un kit de ensayo de acuerdo con la reivindicación 14, cuando depende de la reivindicación 10, para la identificación de patógenos microbianos de 41 E07784579 21-10-2011   infecciones transmitidas a través del torrente sanguíneo en una muestra de sangre, especialmente para vigilar la sangre de un paciente con sepsia, o de un paciente que tiene riesgo de desarrollar sepsia, o para la identificación de patógenos microbianos de la vaginosis en una muestra de fluido vaginal. 42 E07784579 21-10-2011   43 E07784579 21-10-2011   44 E07784579 21-10-2011   E07784579 21-10-2011   46 E07784579 21-10-2011   47 E07784579 21-10-2011   48 E07784579 21-10-2011   49 E07784579 21-10-2011   E07784579 21-10-2011   51 E07784579 21-10-2011   52 E07784579 21-10-2011   53 E07784579 21-10-2011   54 E07784579 21-10-2011   E07784579 21-10-2011   56 E07784579 21-10-2011   57 E07784579 21-10-2011   58 E07784579 21-10-2011