DETECCIÓN, IDENTIFICACIÓN Y DIFERENCIACIÓN DE TAXONES EUBACTERIANOS EMPLEANDO UN ENSAYO DE HIBRIDACIÓN.

Detección, identificación y diferenciación de taxones eubacterianos empleando un ensayo de hibridación CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para la detección y/o identificación específicas de especies de Enterococcus, en particular de Enterococcus faecalis y/o Enterococcus faecium, empleando secuencias nuevas de ácidos nucleicos procedentes de la región ITS (espaciadores de transcripción interna). La presente descripción también se refiere a dichas secuencias nuevas de ácidos nucleicos procedentes de la región ITS, entre los ácidos ribonucleicos ribosomales (ARNr) 16S y 23S o entre los genes de ARNr 16S y 23S, para su uso en la detección y/o identificación específicas de especies de Enterococcus, en particular de Enterococcus faecalis y/o Enterococcus faecium, en una muestra biológica. También se refiere a los cebadores de ácidos nucleicos que se emplean para la amplificación de dicha región de espaciadores de las especies de Enterococcus en una muestra. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Actualmente, el género Enterococcus incluye 27 especies descritas. Desde el punto de vista clínico humano, las especies más importantes son E. faecalis y/o E. faecium: de forma conjunta, E. faecalis y E. faecium representan hasta un 95% de todas las infecciones nosocomiales causadas por enterococos, que se distribuye como un 80-90% y un 5-10%, respectivamente. De forma ocasional, se aíslan E. casseliflavus y E. gallinarum. Cada vez más, se reconoce que los enterococos son causas comunes de infección que resultan difíciles de tratar, debido a su resistencia a los antibióticos tanto inherente como adquirida. El control eficaz de E. faecalis y/o E. faecium en los hospitales y comunidades requiere medidas más agresivas que incluyan un diagnóstico más temprano de los pacientes colonizados, dicho de otra manera, que incluyan un paso de detección sistemática. Además, varias de las especies descritas recientemente no se corresponden con las características fenotípicas empleadas hasta la fecha para su identificación. Por consiguiente, resulta necesario y urgente obtener métodos más rápidos de detección y/o identificación, empleando sondas y/o cebadores más sensibles y más específicos. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Un objeto de la presente invención es proporcionar secuencias nuevas de ácidos nucleicos procedentes de una región particular de ITS de las especies de Enterococcus, que se puedan emplear para la detección y/o identificación de las especies de Enterococcus, en particular de Enterococcus faecalis y/o Enterococcus faecium. Por lo tanto, la presente descripción proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO 1 ó 2, la forma de ARN de dicha SEQ ID NO 1 ó 2, donde T se reemplaza por U, la forma complementaria de dicha SEQ ID NO 1 ó 2 o cualquier homóloga, y el uso de dicha molécula de ácido nucleico como una diana para la detección y/o identificación de especies de Enterococcus. Un aspecto de la presente invención se refiere a polinucleótidos nuevos para su uso como sondas, que tienen como diana una región particular de la región de espaciadores de ARNr 16S-23S de las especies de Enterococcus, y que permiten la detección y/o identificación de especies de Enterococcus, en particular de Enterococcus faecalis y/o Enterococcus faecium. Por lo tanto, la presente descripción proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que se hibrida específicamente con SEQ ID NO 1 ó 2, o con la forma de ARN de dicha SEQ ID NO 1 ó 2, donde T se reemplaza por U, o con la forma complementaria de dicha SEQ ID NO 1 ó 2, o con cualquiera de sus secuencias homólogas, o con un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos de esta, para la detección y/o identificación de especies de Enterococcus, en particular de Enterococcus faecalis y/o Enterococcus faecium. Otro aspecto de la presente invención se refiere a conjuntos de sondas para la detección y/o identificación de especies de Enterococcus, en particular de Enterococcus faecalis y/o Enterococcus faecium, en una muestra. Otro aspecto de la presente descripción se refiere a cebadores que permiten una amplificación específica de la región de espaciadores de ARNr 16S-23S de las especies de Enterococcus, en particular de Enterococcus faecalis 2 E03812592 17-11-2011   y/o Enterococcus faecium. Otro objeto de la presente invención consiste en una composición que contiene cualquiera de los nuevos conjuntos de sondas de la invención. Otro objeto de la presente invención consiste en un kit, en el cual se emplean dichas sondas, para la detección y/o identificación de especies de Enterococcus, en particular de Enterococcus faecalis y/o Enterococcus faecium. Otro objeto de la presente invención consiste en un método de hibridación rápido y fiable para la detección y/o identificación de especies de Enterococcus, en particular de Enterococcus faecalis y/o Enterococcus faecium. Otro objeto de la presente invención consiste en un método de hibridación basado en PCR a tiempo real para la detección y/o identificación de especies de Enterococcus, en particular de Enterococcus faecalis y/o Enterococcus faecium. LEYENDAS DE LAS TABLAS Tabla 1: lista de las SEQ ID Tabla 2: pares cebadores Tabla 3: conjunto de sondas Tabla 4: Especie de Enterococcus DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las siguientes definiciones sirven para ilustrar los términos y las expresiones que se emplean en las diferentes realizaciones de la presente invención, según se expone a continuación. Los términos espaciador e ITS (espaciador de transcripción interna) son términos abreviados que se refieren a la región entre el ARNr 16S y 23S o entre los genes de ARNr 16 S y 23S. El término sonda se refiere a oligonucleótidos o polinucleótidos monocatenarios que contienen una secuencia suficientemente complementaria para hibridarse con la secuencia diana que se desea detectar. Preferentemente, las sondas comparten un 70%, 80%, 90% o más de un 95% de homología con relación al complemento exacto de la secuencia diana que se desea detectar. Estas secuencias diana consisten en ADN genómico o ARN precursor, o versiones amplificadas de estos. Las sondas de la invención se pueden obtener clonando plásmidos recombinantes que contienen injertos que incluyen las secuencias de nucleótidos correspondientes, si es necesario, eliminando estas últimas de los plásmidos clonados empleando las nucleasas adecuadas y recuperándolas, p. ej., mediante fraccionamiento según el peso molecular. Las sondas de acuerdo con la presente invención también se pueden sintetizar químicamente, por ejemplo, mediante el método convencional del fosfotriéster. La expresión ácidos nucleicos complementarios, según se emplea en la presente, se refiere a que las secuencias de los ácidos nucleicos pueden formar una doble hélice perfecta de bases apareadas entre sí. Las expresiones ácido polinucleico, ácido nucleico y polinucleótido se corresponden con ARN o ADN genómico o ADNc monocatenario o bicatenario, que contienen al menos 5, 10, 20, 30, 40 o 50 nucleótidos contiguos. Un ácido polinucleico que contiene menos de 100 nucleótidos de longitud se denomina oligonucleótido. También se pueden referir a nucleótidos modificados tales como la inosina o a nucleótidos que contienen grupos modificados que no alteran esencialmente sus características de hibridación. En la presente invención, las secuencias de ácidos polinucleicos monocatenarios siempre se representan del extremo 5 al extremo 3. Se pueden emplear como tales, en su forma complementaria o en su forma de ARN, donde T se reemplaza por U. La expresión el más cercano se refiere a un taxón, del cual se sabe que es o se espera que sea el más cercano en cuanto a la homología de ADN, y el cual se debe diferenciar del organismo de interés. La expresión hibridación específica para un taxón o sonda específica para un taxón se refiere a que la sonda solo 3 E03812592 17-11-2011   se hibrida con el ADN o ARN del taxón para el cual se ha diseñado y no se hibrida con el ADN o ARN de otros taxones. El término taxón se puede referir a un género completo o a un subgrupo de un género, a una especie o incluso a un subtipo de una especie (subespecies, serovares, sequevares, biovares). La expresión amplificación específica o cebadores específicos se refiere al hecho de que dichos cebadores solo amplifican la región del espaciador de aquellos organismos para los cuales se han diseñado y no de otros organismos. El término sensibilidad se refiere al número de negativos falsos: es decir, si 1 de cada 100 cepas que se deberían detectar, no se detecta, el ensayo presentará una sensibilidad de (100-1/100)% = 99%. El término especificidad se refiere al número de positivos falsos: es decir, si de cada 100 cepas detectadas, parece ser que 2 pertenecen a... [Seguir leyendo]

1. Un conjunto de dos o tres sondas de polinucleótidos, donde dichas sondas se hibridan específicamente con SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2, o con su forma de ARN, donde T se reemplaza por U, o con su forma complementaria, donde no hay más de 25 nucleótidos entre dichas sondas, para la identificación de E. faecalis y/o E. faecium, que consisten en SEQ ID NO 29 y 68; 34 y 69; 53 y 69; 53 y 72; 55 y 73; 56 y 73; 82 y 73; 36, 56 y 73; y 36, 82 y 73. 2. Una composición que comprende un conjunto de sondas de polinucleótidos según se ha definido en la reivindicación 1. 3. Un método para la detección y/o identificación de especies de E. faecalis y/o E. faecium en una muestra que comprende los pasos de: (i) si resulta necesario, liberar, aislar y/o concentrar los ácidos polinucleicos en la muestra; (ii) si resulta necesario, amplificar la región de espaciadores de ARNr 16S-23S, o un fragmento que comprenda la secuencia diana, o la secuencia diana o un fragmento de esta, con al menos un par cebador adecuado; (iii) hibridar los ácidos polinucleicos del paso (i) o (ii) con el conjunto de sondas de polinucleótidos, según se define en la reivindicación 1; (iv) detectar los híbridos formados, realizando un análisis de curva de fusión, y (v) interpretar la(s) señal(es) obtenida(s) y deducir la presencia de especies de E. faecalis y/o E. faecium en la muestra. 4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, donde un par cebador adecuado está constituido por cualquier combinación de un polinucleótido cebador directo, seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 y sus homólogas, y un polinucleótido cebador inverso, seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 y sus homólogas. 5. Un kit para la detección y/o identificación de especies de Enterococcus que comprende los siguientes componentes: - un conjunto de dos o tres sondas de polinucleótidos, según se ha definido en la reivindicación 1 - un tampón de hibridación o los componentes necesarios para producir dicho tampón. 24 E03812592 17-11-2011