Método para producir un éster de hidroxiácido, comprendiendo el método la mezcla de un donador de acilos,

un aceptor de acilos y agua, con el fin de producir un ambiente de alto contenido de agua que comprenda de entre el 5% y el 98% de agua, en el que dicho donador de acilos es un sustrato lípido seleccionado de entre uno o más del grupo constituido por un fosfolípido, un lisofosfolípido, un triacilglicérido, un diglicérido, un glucolípido o un lisoglucolípido, y dicho aceptor de acilos es un hidroxiácido, y poner en contacto la mezcla con una lípido aciltransferasa, de manera que dicho lípido aciltransferasa cataliza una cualquiera o las dos reacciones siguientes: alcoholisis o transesterificación, en el que la lípido aciltransferasa se caracteriza por un enzima que presenta actividad de aciltransferasa y que comprende la secuencia de aminoácidos motivo GDSX, en el que X es uno o más de los residuos aminoácidos siguientes: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para la bioconversión de lípidos con el fin de producir un éster de hidroxiácido mediante la utilización de una lípido aciltransferasa.

Asimismo, la presente invención se refiere a la utilización de una lípido aciltransferasa para bioconvertir un lípido en un éster de hidroxiácido.

Se da a conocer como referencia una lípido aciltransferasa inmovilizada.

Antecedentes de la técnica

Las lipasas han sido ampliamente utilizadas en la bioconversión de lípidos para preparar productos de alto valor, por ejemplo ésteres de azúcar, para la utilización en un amplio abanico de industrias, incluyendo las industrias alimentarias y/o de piensos, las industrias cosmética y/o de cuidado de la piel, la industria oleoquímica y la industria farmacéutica.

En el caso de que los procedimientos de bioconversión requieran la hidrólisis de sustratos lipídicos, pueden utilizarse enzimas lipolíticos en ambientes con alto contenido de agua. Sin embargo, en el caso de que los procedimientos de bioconversión requieran reacciones de interesterificación o transesterificación, tal como la alcoholisis, la utilización de lipasas en ambientes con alto contenido de agua puede resultar perjudicial debido a reacciones de hidrólisis no deseadas, que resultan en productos biológicos no deseados y/o rendimientos más bajos del producto de bioconversión.

Típicamente, los procedimientos de bioconversión que requieren interesterificación y/o transesterificación utilizan lipasas en ambientes no acuosos tales como sistemas de aceite y/o en sistemas de solventes orgánicos, tales como butanol, metanol o hexano. Estos sistemas proporcionan un ambiente en el que tanto la molécula aceptora polar como la molécula donadora lipídica puede solubilizarse por lo menos parcialmente, y la lipasa presenta suficiente actividad enzimática. Aunque resulta necesaria una pequeña cantidad de agua para cualquier actividad enzimática, la cantidad de agua se mantiene estrictamente a nivel reducido para evitar la actividad hidrolítica del enzima.

Convencionalmente se han producido ésteres de azúcar, esteres de proteína o ésteres de hidroxiácido mediante síntesis química utilizando catalizadores inorgánicos. Los procedimientos convencionales de bioconversión para la producción de ésteres de azúcar o ésteres de hidroxiácido utilizan lipasas en ambientes de solventes orgánicos o líquidos supercríticos en los que únicamente existe una cantidad reducida (o nula) de agua.

Lecointe et al., Biotechnology Letters Vol. 18, nº 8 (agosto):869-874, dan a conocer un estudio de varios enzimas lipasa y su actividad en un medio acuoso sobre la producción de éster metílico o éster butílico a partir de metanol y butanol, respectivamente. Lecointe et al. enseñan una lipasa/aciltransferasa de Candida parapsilosis que, a medida que se incrementaban las concentraciones de metanol o de butanol, mostraba una actividad de hidrólisis reducida y una capacidad incrementada del enzima de producir éster metílico y éster butílico. La utilización de una lipasa/aciltransferasa de C. parapsilosis en la producción de ácido hidroxámico graso se enseña en Vaysse et al., J. of Biotechnology 53:41-46, (1997).

La patente WO 00/05396 da a conocer la utilización de un agente de conversión para preparar a partir de un material alimentario un alimento que comprende por lo menos un ingrediente funcional, en el que por lo menos un ingrediente funcional ha sido generado a partir de por lo menos un constituyente del material alimentario por parte del agente de conversión.

Las lipasa:colesterol aciltransferasas han sido conocidas desde hace tiempo (ver, por ejemplo, Buckley, Biochemistry 22:5490-5493, 1983). En particular, se han encontrado las glicerofosfolípido:colesterol aciltransferasas (con frecuencia denominadas GCAT), que, al igual que las lecitina:colesterol aciltransferasas (LCAT) vegetales y/o de mamífero, catalizan la transferencia de ácidos grasos entre la fosfatidilcolina y el colesterol.

Upton y Buckley (TIBS 20:178-179, mayo de 1995) y Brumlik y Buckley (J. of Bacteriology, páginas 2060 a 2064, abril de 1996) enseñan una lipasa/aciltransferasa de Aeromonas hydrophila que presenta la capacidad de llevar a cabo la transferencia de acilos hasta aceptores alcohol en un medio acuoso.

Además, también se ha introducido la secuencia de la aciltransferasa de A. salmonicida en la base de datos EBI UNIPROT el 1 de marzo de 2001 bajo el nº de acceso Q9F7Y6.

Aspectos del sumario de la presente invención

Según un primer aspecto de la presente invención se proporciona un método para producir un éster de hidroxiácido, comprendiendo el método la mezcla de un donador de acilos, un aceptor de acilos y agua para producir un ambiente de alto contenido de agua, comprendiendo entre el 5% y el 98% de agua, en el que dicho donador de acilos es un sustrato lípido seleccionado de entre uno o más del grupo que consiste en un fosfolípido, un lisofosfolípido, un triacilglicérido, un diglicérido, un glucolípido o un lisoglucolípido y siendo dicho aceptor de acilos un hidroxiácido, y poner en contacto la mezcla con una lípido aciltransferasa, de manera que dicha lípido aciltransferasa cataliza una cualquiera o las dos reacciones siguientes: alcoholisis o transesterificación, en las que la lípido aciltransferasa se caracteriza como un enzima que presenta actividad aciltransferasa y que comprende el motivo de secuencia de aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de los residuos aminoácidos siguientes: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M

o S.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona la utilización de una lípido aciltransferasa para producir un éster de hidroxiácido mediante catálisis de una cualquiera o las dos reacciones siguientes: alcoholisis y transesterificación, en una mezcla de un donador de acilos, un aceptor de acilos y agua, comprendiendo la mezcla entre el 5% y el 98% de agua, en la que dicho donador de acilos es un sustrato lípido seleccionado de entre uno o más del grupo que consiste en un fosfolípido, un lisofosfolípido, un triacilglicérido, un diglicérido, un glucolípido o un lisoglucolípido, y siendo dicho aceptor de acilos un hidroxiácido, en el que la lípido aciltransferasa se caracteriza como un enzima que presenta actividad de aciltransferasa y que comprende el motivo de secuencia de aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de los residuos aminoácidos siguientes: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.

También se dan a conocer un éster de hidroxiácido producido mediante un método según la presente invención, un farmacéutico, un cosmético, un producto alimentario, un pienso, una pintura que comprende un éster de hidroxiácido producido mediante un método según la presente invención, y un enzima lípido aciltransferasa inmovilizado.

Aspectos detallados de la presente invención

La expresión "lípido aciltransferasa" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un enzima que además de presentar actividad de lipasa (generalmente clasificada como E.C.3.1.1.x de acuerdo con la Enzyme Nomenclature Recommendations (1992) del comité de nomenclatura de la International Union of Biochemistry and Molecular Biology) también presenta actividad de aciltransferasa (generalmente clasificada como E.C.2.3.1.x), según la cual el enzima es capaz de transferir un grupo acilo de un lípido a uno o más de los sustratos aceptores siguientes: un carbohidrato, una proteína, una subunidad de proteína o un hidroxiácido.

Preferentemente, el "aceptor de acilos" según la presente invención no es agua.

El enzima es capaz de transferir un grupo acilo de un sustrato lípido a un hidroxiácido.

Convenientemente, el hidroxiácido puede ser uno o más de los ácidos siguientes: ácido cítrico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido ascórbico, ácido glicólico, ácido málico, ácido alfa-hidroxietanoico, ácido alfa-hidroxioctanoico, ácido alfa-hidroxicaprílico, ácido hidroxicaprílico, ácido glucónico, ácido lactobiónico o ácido maltobiónico.

Convenientemente, el hidroxiácido puede ser un ácido frutal, por ejemplo uno o más de entre ácido málico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido cítrico o ácido glicólico.

En una forma de realización, preferentemente el hidroxiácido es uno o más de los ácidos siguientes: ácido cítrico,... [Seguir leyendo]

1. Método para producir un éster de hidroxiácido, comprendiendo el método la mezcla de un donador de acilos, un aceptor de acilos y agua, con el fin de producir un ambiente de alto contenido de agua que comprenda de entre el 5% y el 98% de agua, en el que dicho donador de acilos es un sustrato lípido seleccionado de entre uno o más del grupo constituido por un fosfolípido, un lisofosfolípido, un triacilglicérido, un diglicérido, un glucolípido o un lisoglucolípido, y dicho aceptor de acilos es un hidroxiácido, y poner en contacto la mezcla con una lípido aciltransferasa, de manera que dicho lípido aciltransferasa cataliza una cualquiera o las dos reacciones siguientes: alcoholisis o transesterificación, en el que la lípido aciltransferasa se caracteriza por un enzima que presenta actividad de aciltransferasa y que comprende la secuencia de aminoácidos motivo GDSX, en el que X es uno o más de los residuos aminoácidos siguientes: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la lípido aciltransferasa se encuentra inmovilizada.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el método comprende purificar el éster de hidroxiácido.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el enzima lípido aciltransferasa comprende H-309 o comprende un residuo histidina en una posición correspondiente a His-309 en la secuencia de aminoácidos del enzima lipolítico de Aeromonas hydrophila mostrada como SEC ID nº 2 ó SEC ID nº 32.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la lípido aciltransferasa es obtenible a partir de un organismo de uno o más de los géneros siguientes: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la lípido aciltransferasa comprende una o más de las secuencias de aminoácidos siguientes:

(i) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 2, (ii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 3, (iii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 4, (iv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 5, (v) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 6, (vi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 12, (vii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 20, (viii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 22, (ix) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 24, (x) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 26, (xi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 28, (xii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 30, (xiii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 32, (xiv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 34, o una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de 75% o superior respecto a cualquiera de las secuencias mostradas como SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 12, SEC ID nº 20, SEC ID nº 22, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26, SEC ID nº 28, SEC ID nº 30, SEC ID nº 32 ó SEC IDnº 34.

7. Método según la reivindicación 1, en el que el enzima lípido aciltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos producida mediante la expresión de una o más de las secuencias de nucleótidos siguientes:

(a) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 7 (ver la figura 9),

(b) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 8 (ver la figura 10),

(c) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 9 (ver la figura 11),

(d) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 10 (ver la figura 12),

(e) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 11 (ver la figura 13),

(f) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 13 (ver la figura 15),

(g) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 21 (ver la figura 17),

(h) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 23 (ver la figura 19),

(i) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 25 (ver la figura 21),

(j) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 27 (ver la figura 23),

(k) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 29 (ver la figura 25),

(l) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 31 (ver la figura 27),

(m) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 33 (ver la figura 29),

(n) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 35 (ver la figura 31), o

(o) una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de 75% o superior respecto a cualquiera de las secuencias mostradas como SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 13, SEC ID nº 21, SEC ID nº 23, SEC ID nº 25, SEC ID nº 27, SEC ID nº 29, SEC ID nº 31, SEC ID nº 33 ó SEC ID nº 35.

8. Utilización de una lípido aciltransferasa para producir un éster de hidroxiácido mediante catálisis de una o las dos reacciones alcoholisis o transesterificación en una mezcla de un donador de acilos, un aceptor de acilos y agua, comprendiendo la mezcla entre el 5% y el 98% de agua, en la que dicho donador de acilos es un sustrato lípido

seleccionado de entre uno o más del grupo que consiste en un fosfolípido, un lisofosfolípido, un triacilglicérido, un diglicérido, un glucolípido o un lisoglucolípido y dicho aceptor de acilos es un hidroxiácido, en el que la lípido aciltransferasa se caracteriza por un enzima que presenta actividad de aciltransferasa y que comprende la secuencia de aminoácidos motivo GDSX, en el que X es uno o más de los residuos aminoácidos siguientes: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, Mo S.

9. Utilización según la reivindicación 8, en la que la lípido aciltransferasa se encuentra inmovilizada.

10. Utilización según la reivindicación 8, en la que el éster de hidroxiácido se ha purificado.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la que el enzima lípido aciltransferasa comprende H-309 o comprende un residuo histidina en una posición correspondiente a His-309 en la secuencia de aminoácidos del enzima lipolítico de Aeromonas hydrophila mostrada como SEC ID nº 2 ó SEC ID nº 32.

12. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en la que la lípido aciltransferasa es obtenible a partir de un organismo de uno o más de los géneros siguientes: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.

13. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en la que la lípido aciltransferasa comprende una o más de las secuencias de aminoácidos siguientes: (i) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 2, (ii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 3, (iii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 4, (iv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 5, (v) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 6, (vi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 12, (vii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 20, (viii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 22, (ix) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 24, (x) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 26, (xi) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 28, (xii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 30, (xiii) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 32, (xiv) la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 34, o una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de 75% o superior respecto a cualquiera de las secuencias mostradas como SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 12, SEC ID nº 20, SEC ID nº 22, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26, SEC ID nº 28, SEC ID nº 30, SEC ID nº 32 ó SEC ID nº 34.

14. Utilización según la reivindicación 8, en la que el enzima lípido aciltransferasa comprende una secuencia de aminoácidos producida mediante la expresión de una o más de las secuencias de nucleótidos siguientes:

(a) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 7 (ver la figura 9),

(b) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 8 (ver la figura 10),

(c) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 9 (ver la figura 11),

(d) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 10 (ver la figura 12),

(e) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 11 (ver la figura 13),

(f) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 13 (ver la figura 15),

(g) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 21 (ver la figura 17),

(h) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 23 (ver la figura 19),

(i) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 25 (ver la figura 21),

(j) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 27 (ver la figura 23),

(k) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 29 (ver la figura 25),

(l) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 31 (ver la figura 27),

(m) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 33 (ver la figura 29),

(n) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID nº 35 (ver la figura 31), o

(o) una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de 75% o superior respecto a cualquiera de las secuencias mostradas como SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 13, SEC ID nº 21, SEC ID nº 23, SEC ID nº 25, SEC ID nº 27, SEC ID nº 29, SEC ID nº 31, SEC ID nº 33 ó SEC ID nº 35.